KLINIČNI PRIMER

Prej zdravo, 35–letno žensko najdejo v zmedenem stanju. Diha plitko in upočasnjeno ter je cianotična. Zaradi poskusov samomora v preteklosti pomislijo na samozastrupitev.
Po sprejemu v bolnišnico preneha dihati, krvni tlak pade, srčna frekvenca je upočasnjena, zenice so močno zožene. Bolnica postane komatozna. Plinska analiza arterijske krvi pokaže hudo kombinirano respiratorno in metabolno acidozo: pH = 6,25 (normalno 7,4), pO2 = 54 mmHg (normalno 95 ± 5 mmHg), pCO2 = 79 mmHg (normalno 40 ± 2 mmHg). Meritev aktivnosti serumske holinesteraze: 300U/L (normalno 2400 – 5000). Takoj pričnejo z naslednjimi ukrepi: umetno dihanje, spiranje želodca, dajanje aktivnega oglja in odvajal, masaža srca, injiciranje atropina, diazepama, obidoksima.


NAČINI IN ZNAKI ZASTRUPITVE

Načini:

Organofosfati so kemično estri fosforne kisline ali njenih derivatov. Biološko so inhibitorji holinesteraz, med katerimi je po pomenu, ki ga le-te imajo v sliki zastrupitve, najpomembnejša acetilholinesteraza ( AChE ).
Organofosfati se uporabljajo kot insekticidi v kmetijstvu ( npr. paration, malation ), v skupino organofosfatov pa spada tudi več živčnih bojnih strupov, med katerimi je tudi sarin, ki so ga uporabili teroristi l. 1995 na Japonskem.

Zastrupitev je lahko akcidentalna ( uporaba insekticidov ob neustrezni zaščiti ( kmetje, neprimerno shranjevanje – otroci , nesreče v proizvodnji ) ali namerna (samomor, uporaba živčnih bojnih strupov).
Zastrupitev je možna predvsem na 3 načine:
- z zaužitjem ( samomorilci, otroci )
- vdihavanje hlapov, aerosolov ( škropljenje z insekticidi ob neustrezni zaščiti, uporaba bojnih strupov )
- absorpcija preko kože in veznic, če pridejo kapljice strupa v stik s kožo ( bojni strupi, škropljenje z insekticidi). .

Znaki zastrupitve:

Posledica zastrupitve z organofosfati je povečana koncentracija acetilholina v sinapsah, kjer se ta sprošča, do česar pride zaradi nezadostnega delovanja encima AChE, ki sicer acetilholin razgrajuje. Primarni znaki nastanejo zaradi neposrednega učinka povečane koncentracije in podaljšanega delovanja acetilholina, sekundarni znaki pa kot posledica primarnih ( Razpredelnici 1 in 2). Primarne znake pričakujemo torej kot posledico motenega delovanja v holinergičnih sinapsah, čeravno med znaki lahko najdemo tudi take, ki izvirajo iz povečanega tonusa simpatikusa, kar pojasnjujemo v nadaljevanju.







Razpredelnica 1: Primarni znaki

Sistem Znaki Mehanizem delovanja
Motorična ploščica Tetanične kontrakcije, ki postopoma preidejo v paralizo Trajna prisotnost acetilholina povzroči nenehne vale depolarizacij in tako kontrakcije, sčasoma pa desentizacijo receptorjev in tako paralizo
Centralni živčni sistem Hipotenzija, hipotermija, hipoventilacija, motnje zavesti, konvulzija ( napad krčev ) Kombinacija primarnih učinkov povečane koncentracije acetilholina v sinapsah CŽS in sekundarnih znakov

Posganglijski parasimpatik
Bradikardija, hipotenzija Zmanjšan ritem SA vozla,

Dispnea Povečana sekrecija bronhialnih žlez in bronhokonstrikcija
Količne bolečine, nehotena defekacija in nehoteno uriniranje Kontrakcija gladkih mišic gastrointestinalnega trakta in sečnega mehurja
Solzenje, slinjenje Stimulacija eksokrinih žlez, ki jih oživčujejo parasimpatična vlakna
Mioza Konstrikcija m.sfinktra pupile
Motnje akomodacije
Konstrikcija ciliarne mišice
Simpatik Znojenje Stimulacija znojnic
Bledica Kadar prevladajo vplivi simpatikusa kot odgovor na stres s konstrikcijo arteriol v koži


Razpredelnica 2: Sekundarni znaki

Znaki Mehanizem nastanka
Centralna cianoza Povečan delež deoksigeniranega hemoglobina v arterijski krvi
Periferna cianoza Povečan delež deoksigeniranega hemoglobina v kapilarni krvi zaradi slabe perfuzije in oksigenacije perifernih tkiv

Respiratorna acidoza Hipoventilacija
Metabolna acidoza Anaerobni metabolizem zaradi hipoksije perifernih tkiv


MEHANIZEM NASTANKA ZNAKOV ZASTRUPITVE

Holinergični receptorji

Nahajajo se na postsinaptični membrani holinergičnih sinaps. Holinergične receptorje delimo na nikotinske in muskarinske.

a) Nikotinski receptorji

Nikotinski receptorji spadajo v skupino integralnih transmembranskih proteinov. Veliko jih je na postsinaptični membrani živčnomišičnega stika, najdemo pa jih tudi v motorični ploščici, avtonomnih ganglijih, sredici nadledvičnice in v CŽS.
Nikotinski receptorji delujejo kot hitri kemijsko odvisni ionski kanalčki. Sestavljeni so iz 5 podenot in imajo dve vezavni mesti za ACh. Eno ima višjo afiniteto za ACh in je zasedeno že pri nizkih koncentracijah ACh. Ob vezavi prenašalca pride do odprtja ionskih kanalčkov in povečane prepustnosti za katione (Na, K), kar privede do depolarizacije postsinaptične membrane. Pride do EPSP in ko ta depolarizacija doseže potencial praga, pride do proženja akcijskega potenciala. Amplituda in frekvenca EPSP sta odvisni od koncentracije ACh v sinaptični špranjiin ker je ta pri zastrupitvah z organofosfati zvišana, , v prvi fazi zastrupitve pride do tetaničnih kontrakcij.
Po eni od hipotez pride ob dovolj visoki koncentraciji ACh do vezave tega prenašalca na drugo vezavno mesto na receptorju. To mesto ima manjšo afiniteto za ACh, njegova zasedenost pa onemogoči odpiranje kanalčka kar se pokaže kot desenzitizacija in torej neodzivnost receptorja za ACh. Ko pride do desenzitizacije, ne more nastati EPSP in posledično tudi ne akcijski potencial. Faza tetaničnih kontrakcij zato kmalu preide v fazo, ko imamo opraviti s paralizo skeletne mišice (faza 2).

b) Muskarinski receptorji

Muskarinski receptorji spadajo v skupino integralnih transmembranskih proteinov, ki delujejo na ionske kanalčke preko G proteina. Vezava ACh na receptor aktivira G protein, le-ta pa nato deluje na različne efektorske beljakovine, kot n pr. Na specifične K kanalčke v SA vozlu , kjer se poviša njihova prepustnost. Na različne organe lahko delujejo inhibitorno ali stimulatorno, delujejo pa počasneje kot nikotinski receptorji. Desenzitizacije muskarinskih receptorjev ni, njihov blokator pa je atropin.
Nahajajo se v holinergičnih sinapsah:
• efektorskih organov, ki jih oživčujejo postganglionarna parasimpatična vlakna (srce, GIT, eksokrine žleze, m.cilliaris, m.sphincter pupilae...)
• ponekod v CŽS

INHIBICIJA ACETILHOLINESTERAZE Z ORGANOFOSFATI

Acetilholinesteraza (AChE)

Glede na reakcije s fosfatnimi estri ločimo tri tipe esteraz:

A esteraze (npr. cyt P450) - hidrolizirajo nekatere organofosfate in predstavljajo kot take naravno zaščito. Nahajajo se v plazmi in v hepatocitih, ...

B esteraze (npr. AChE) - organofosfati jih inhibirajo.

C esteraze – z organofosfati ne reagirajo


AChE je serinska esteraza, ki katalizira hidrolizo ACh. Je polimorfna beljakovina, ki jo torej lahko najdemo v organizmu v različnih oblikah. Homomerne oblike imajo samo katalitski del, heteromerne oblike pa imajo poleg katalitskega še strukturni del. Katalitski del AChE je tetramer katalitskih podenot, od katerih ima vsaka podenota en aktivni center. Katalitski del je z disulfidnimi mostički povezan s strukturnim delom. Ta je lahko kolagenski rep, s katerim je esteraza pritrjena na bazalno membrano v motorični ploščici, ali pa je to rep z lipofilnimi predeli, ki omogoča pričvrstitev AChE v lipidni dvosloj celičnih membran. (npr. v holinergičnih sinapsah CŽS).

AChE najdemo tudi na mestih, kjer ni ostalih komponent holinergičnega sistema, kot npr. v plazmi in na eritrocitni membrani. Funkcionalni pomen AChE na teh mestih je neznan, saj inhibicija te AChE ne povzroči nobenih kliničnih znakov. Predstavljajo pa naravno zaščito pri zastrupitvah z organofosfati, saj vežejo del strupa in zmanjšajo njegovo koncentracijo ter tako tudi stopnjo inhibicije AChE. »Neholinergične« AChE imajo torej zaščitno vlogo.

AChE lahko hidrolizira 6 X 105 ACh molekul/molekulo encima na minuto.


Struktura organofosfatov

Kemijsko so to estri fosforne kisline in njenih derivatov.


Reakcija organofosfata z AChE je po mehanizmu nukleofilna substitucija, kjer se na elektrofilnem atomu fosforja zamenjata dva nukleofila. Pri tem predstavlja X »zapuščajočo skupino«(»leaving group«), ki se zamenja s kisikovim atomom serinskega ostanka v aktivnem centru AChE. Če je X dobro obstojen kot anion, bo imel veliko tendenco zapustiti P atom. Reakcija s takim organofosfatom bo hitrejša in doza, potrebna za zastrupitev je zato nižja. Pri organofosfatih, ki so bojni strupi, se na mestu X ponavadi nahaja F. Fluorid je kot anion dobro obstojen, nukleofilne substitucije med njim in serinsko OH skupino v aktivnem centru AChE so zelo hitre.

B, B bazična skupina je lahko alkil, amin, alkohol ali amidna skupina. Bazična skupina določa stabilnost celotne molekule, polarnost vezi P–X in lipidotopnost organofosfata. Daljši kot sta alkilni verigi, bolj je organofosfat lipidotopen in zato lažje prehaja preko celične membrane ali pa hematoencefalne bariere.



Reakcija organofosfatov z acetilholinesterazo

Reakcija poteka v treh stopnjah:

1. Nastanek adsorbcijskega kompleksa
2. Nukleofilna substitucija
3. Hidroliza fosforilirane AChE

Razlika med reakcijama, ko hidrolizira AChE svoj naravni substrat ACh ali pa organofosfat, je predvsem v tretji stopnji, ko poteka hidroliza bodisi acetiliranega ali pa fosforiliranega serinskega ostanka v aktivnem centru AChE. Acetiliran encim (nastane pri reakciji z ACh, slika 1) se hidrolizira veliko hitreje kot fosforiliran encim (reakcija z organofosfati, slika 2). Fosforiliran encim tako ne more hidrolizirati svojega naravnega substrata acetilholina in je torej inhibiran.



Slika 1: Reakcija acetilholina z aktivnim centrom AChE:


Slika 2: Shema reakcije organofosfata z aktivnim centrom AchE:


Hidrolizi fosforiliranega encima pravimo tudi psevdoireverzibilna, ker je sicer reverzibilna, vendar defosforilacija poteka tako počasi, da se v kinetičnih merjenjih ugotovi slika ireverzibilne inhibicije.

Detoksifikacija organofosfatov poteka v plazmi in v jetrih. Njihova hidroliza z A esterazami ne tvori stabilnih intermediatov, produkti se izločijo z urinom, manjši del organofosfatov se izloči nespremenjen (predvsem lipidotopni), lahko pa se nalagajo v organizmu in povzročajo ponovne zastrupitve.


DIAGNOSTIKA

Zastrupitev z organofosfati je akutno stanje, ki ga je potrebno hitro prepoznati saj lahko, če ni ustreznega ukrepanja, bolnik ob dovolj visoki dozi že v nekaj minutah umre. Pri diagnozi si tako lahko največ pomagamo z anamnezo, heteroanamnezo, okoliščinami, v katerih se je bolnik nahajal in kliničnimi znaki. Testi za določanje aktivnosti eritrocitne in plazemske acetilholinesteraze nam sicer zanesljivo povedo, da je šlo za zastrupitev z inhibitorji AChE, a dobimo rezultate ponavadi šele potem, ko je moral biti najpomembnejši del terapije že opravljen.
.
Nekateri znaki, značilni za zastrupitev z organofosfati, so lahko pri blažjih oblikah zastrupitve prikriti zaradi prestrašenosti zastrupljenca in s tem povezane aktivacije simpatika (npr. bradikardija je lahko slabo izražena ali pa pride celo do tahikardije).
Značilni znaki zastrupitve so tudi slinjenje, solzenje, uriniranje in defekacija (SLUD – Salivation, Lacrimation, Urination, Defecation). Predvsem pri otrocih, mlajših od treh let, moramo paziti, da ne zamenjamo defekacije in uriniranja, ki sta posledica zastrupitve, z razvojno pogojeno nezmožnostjo zadrževanja izločkov. Tudi solzenje ni zanesljiv znak, saj je lahko posledica joka zaradi strahu ali bolečine.
Pri zastrupljencu lahko zaznamo tudi zadah po topilih, v katerih so raztopljeni organofosfati (predvsem po zaužitju insekticidov). Podoben zadah lahko ima npr. tudi komatozen bolnik z diabetično ketoacidozo. Zato moramo pri komatoznem pacientu preveriti več znakov, kar nam pomaga razločiti zastrupitev z organofosfati od ostalih možnosti. .


ZDRAVLJENJE

 PRVA POMOČ

Najprej ločimo pacienta (zastrupljenca) od vira zastrupitve. Preverimo dihanje in bitje srca ter ravnamo v skladu s postopki nujne medicinske pomoči: zagotovimo proste dihalne poti; če je potrebno, izvajamo umetno dihanje in z masko dovajamo kisik; hkrati, ob morebitnem zastoju srca, izvajamo masažo srca.
Kontaminirano obleko odstranimo, kontaminirane dele telesa spiramo z vodo in milom ali z Na-bikarbonatom. Pri oralni zastrupitvi nezavestnemu izpiramo želodec, zavestnemu povzročimo bruhanje. Takoj za tem damo aktivno oglje, ki na sebe veže odvajala in strupene snovi, da se te ponovno ne resorbirajo v kri. Spremljajoče krče blažimo z Diazepamom. Pri tem moramo vseskozi paziti, da se ne zastrupimo sami.

 SIMPTOMATSKO ZDRAVLJENJE

Uporabljamo ATROPIN, ki deluje antagonistično na muskarinske receptorje in torej blaži znake povečanega parasimpatikotonusa: zmanjšuje prekomerno trahealnobronhialno sekrecijo in sekrecijo žlez slinavk ter zviša frekvenco srca.
Atropin apliciramo v količinah zadostnih za prestop čez možgansko bariero – injiciramo ga intravenozno ali intramuskularno vsakih 5-10 minut, dokler ne izginejo muskarinski simptomi, oz. se začnejo kazati znaki atropinizacije: suha usta, tahikardija, obstipacija, lahko tudi povišana telesna temperatura.
Atropin ne deluje na nikotinske receptorje, ki jih najdemo v motorični ploščici in zato nima vpliva na periferno nevromuskularno hiperaktivnost in paralizo, ki ji sledi.

 ETIOLOŠKO ZDRAVLJENJE

Etiološko zdravljenje pomeni odstraniti vzrok zastrupitve. V tem primeru gre torej za odpravo inhibicije AChE. To lahko dosežemo z reaktivatorji AChE, ki so kemično oksimi. Gre za to, da na P atomu, kamor se je po nukleofilni substituciji z zapuščajočo skupino organofosfatov vezala OH skupina aktivnega centra AChE, (glej sliko 4) izvedemo ponovno nukleofilno substitucijo, kjer se bo OH skupina, ki bo zapustila P atom (reaktivacija AChE) nadomestila z oksimsko skupino. Terapijo vseskozi spremljamo z merjenjem aktivnosti AChE v serumu. Oksimfosfat, ki nastane ob regeneraciji, je v bistvu ponovno organofosfat; klinično so uporabni le oksimi, katerih oksimfosfati niso toksični.
Fosforilirana ChE začne hitro kazati nezmožnosti reaktivacije z oksimom oz. se »stara« in postane rezistentna na ChE reaktivatorje. Gre za odcep ene alkilne sk. na organofosfatnem delu, vezanem na ChE, kar spremeni obliko aktivnega centra in onemogoči reaktivacijo z oksimi.