FIZIOLOŠKI TEMELJI ZASTRUPITVE Z ORGANOFOSFATI

Motnje v prenosu signala pri zastrupitvi z organofosfati nastanejo kot posledica zelo učinkovite inhibicije acetilholinesteraze (AChE), zato se acetilholin (ACh) kopiči v holinergičnih sinapsah v nenormalno visokih koncentracijah. Poruši se specifično razmerje med kvanti sproščenega ACh in njegovim z delovanjem AChE pogojenim normalnim učinkom na postsinaptično membrano in nevron.

Lokalizacija holinergičnih sinaps

Holinergične sinapse se nahajajo v:

simpatikus -ganglijih-stiku postganglionarnega nevrona z znojnico-stiku preganglionarnega nevrona s celicami sredice nadledvičnice
parasimpatikus -ganglijih-stiku postganglionarnih nevronov s celicami efektorjev
centralno živčevje -bazalnih ganglijih-stikih Betzovih celic motoričnega korteksa-v drugih živčnih poteh (ni povsem znano)
motorična ploščica -stik a-motonevrona in skeletnega mišičnega vlakna

Holinergični receptorji

a) Nikotinski receptorji (nAChR)

Nikotinski receptor je integralni membranski protein, ki prehaja fosfolipidni dvosloj postsinaptične membrane. Sestavljen je iz 5 podenot (od katerih sta a identični), ki obdajajo ionski kanal s hitrim delovanjem. Receptorji se nahajajo na postsinaptični membrani v visokih koncentracijah, na drugih delih nevrona pa v zanemarljivih. Značilna je denervacijska supersenzitivnost. Poenostavljeno si lahko predstavljamo, da imajo receptorji dve mesti: eno z višjo in eno z nižjo afiniteto za ACh. Mesto z višjo afiniteto je zasedeno ob nižjih koncentracijah ACh in povzroči odprtje nespecifičnega kationskega kanalčka, ki privede do depolarizacije postsinaptične membrane, ta pa se z električnim prevajanjem razširi na sosednja področja. Trenutna depolarizacija (odvisna od vsote ekscitatornih postsinaptičnih potencialov - EPSP) mora doseči vrednost praga, da se generira akcijski potencial, in je zato odvisna od koncentracije iz presinaptične membrane sproščenega ACh. Ob višjih koncentracijah ACh le-ta zasede tudi mesta z nižjo afiniteto, kar povzroči zaprtje ionskih kanalčkov - pride do desenzibilizacije receptorjev.

Za zastrupitev z organofosfati je v prvi fazi (še dovolj nizka koncentracija ACh) tako značilna stalna stimulacija nikotinskih receptorjev, v drugi fazi pa njihovo nedelovanje, povezano z desenzibilizacijo. Najopaznejše posledice prve faze so hitre, iregularne kontrakcije posameznih motoričnih enote (fascikulacije), druge pa paraliza mišic.

Nikotinski receptorji so razen za motorično ploščico značilni še za vse avtonomne ganglije, sredico nadledvičnice in nekatere dele CŽS.

b) Muskarinski receptorji (mAChR)

So integralni membranski proteini, ki delujejo na ionske kanalčke neposredno preko G proteina (brez sekundarnega obveščevalca). Farmakološko ločimo 5 podtipov, npr. pri M2 delujejo na specifične kalijeve kanalčke - vezava ACh aktivira inhibitorni G protein, pride do njegove disociacije, bc-dimer deluje na specifične K-kanalčke in poviša njihovo prepustnost. Na znotrajcelične efektorje lahko delujejo inhibitorno ali stimulatorno, delujejo pa počasneje kot nAChR. Desenzibilizacija receptorjev za mAChR ni značilna. Pomemben blokator je atropin, ki se v ta namen uporablja v simptomatskem zdravljenju zastrupitve.

Značilni so za holinergične sinapse efektorskih organov, ki jih oživčujejo postganglionarna parasimpatična vlakna (srce, eksokrine žleze, GIT, m. ciliaris, m. sphincter pupillae...) in nekatere dele CŽS.

1.3. Acetilholinesteraza

Drugi najučinkovitejši encim hidrolizira ACh v holin in acetat. Nahaja se na zunanji površini postsinaptične membrane (pritrjena z disulfidnimi mostički v bazalni lamini sinaptične špranje pri motorični ploščici). Je serinska esteraza, katere katalitski del je sestavljen iz tetramerov katalitskih podenot. Mehanizem delovanja, pomemben za razumevanje zastrupitve na molekularnem nivoju, je opisan v nadaljevanju.

V eritrocitih, plazmi in drugod so našli različne tipe AChE, katerih funkcija ni jasna, pri zastrupitvi pa vežejo organofosfate in nižajo njihovo koncentracijo. Bistvenega pomena so ti encimi v diagnostiki.

1.4. Naravna zaščita pred zastrupitvijo z organofosfati

Naravno zaščito pred zastrupitvijo z organofosfati do določene mere predstavljajo esteraze A, ki nekatere od njih hidrolizirajo. Nahajajo se v plazmi, ER hepatocitov in drugod. Sem sodijo nekateri citokromi P450. (AChE je esteraza B, ki jo organofosfati inhibirajo. Na esteraze C organofosfati nimajo vpliva.)

ZNAKI IN SIMPTOMI

Organofosfati lahko vstopijo v telo peroralno, perkutano ali z inhalacijo aerosolov. Na mestu vstopa organofosfata v telo se razvijejo lokalni znaki, že čez nekaj minut pa pride do razvoja sistemskih znakov zastrupitve. Ker je to urgentno stanje, sta takojšnja postavitev diagnoze in temu primerno zdravljenje nujna za preživetje zastrupljenca. Za diagnostiko so ključnega pomena znaki in simptomi, ki se ob zastrupitvi razvijejo.
Ločimo primarne in sekundarne znake in simptome. Primarni se razvijejo kot posledica delovanja organofosfatov na motorično ploščico, periferni avtonomni živčni sistem in centralni živčni sistem. Sekundarni pa so posledica razvoja primarnih znakov.

PRIMARNI ZNAKI

1) MOTORIČNA PLOŠČICA
Pri zastrupitvi z OF pride do kopičenja ACh v sinaptični špranji živčno – mišičnega stika. To povzroči v prvi fazi nastanek fascikulacij in tetaničnih kontrakcij. V drugi fazi pride do desenzibilizacije nikotinskih receptorjev, kar vodi v paralizo.

2) AVTONOMNI ŽIVČNI SISTEM
Zaradi inhibicije AChE pride v sinapsah postganglionarnih nevronov parasimpatikusa do kopičenja ACh, kar poveča tonus parasimpatikusa. Znaki, ki se pojavijo:
· bradikardija /zmanjšanje frekvence proženja SA vozla, zmanjšanje hitrosti prenosa impulzov v ventrikle/
· hipotenzija
· mioza /pov.stimulacija m. sphincter pupillae/
· slinjenje, solzenje /povečana sekrecija žlez slinavk in solznic/
· nehotena mikcija in defekacija
· tiščanje v prsih in piskajoče dihanje, ki se pojavita zaradi bronhokonstrikcije in bronhosekrecije

Znaki in simptomi (znojenje, bledica in tahikardija), ki so posledica povečanega simpatikotonusa, se pojavijo kot odgovor na stres in ne zaradi zastrupitve z OF.

3) CENTRALNI ŽIVČNI SISTEM
Organofosfati delujejo tudi na ACh sinapse v CŽS, ki pa so manj raziskane in opredeljene kot ACh sinapse perifernega živčnega sistema. Hipotenzija naj bi bila posledica delovanja OF na vazomotorični sistem v podaljšani hrbtenjači, hipoventilacija pa se razvije zaradi inhibicije respiratornega centra. Pri učinkih OF na CŽS se lahko pojavijo še: zmedenost, nejasen govor, zamegljen vid, fascikulacije.


SEKUNDARNI ZNAKI
Centralna cianoza se lahko razvije zaradi hipoventilacije, periferna cianoza pa je posledica bradikardije. Hipoventilacija vodi tudi do nastanka respiratorne acidoze, nastanek metabolne acidoze pa je povezan s hipoksijo tkiv na periferiji (povišana koncentracija laktata v krvi).












ZNAKI IN SIMPTOMI

PRIMARNI SEKUNDARNI
MOTORIČNA PLOŠČICA PARASIMPATIKUS SIMPATIKUS CŽS centralna cianoza
fascikulacije bradikardija tahikardija hipotenzija periferna cianoza
tetanične kontrakcije hipotenzija znojenje hipoventilacija respiratorna acidoza
paraliza mioza bledica zmedenost metabolna acidoza
slinjenje nejasen govor
solzenje zamegljen vid
nehotena mikcija fascikulacije
nehotena defekacija / diareja
tiščanje v prsih in piskajoče dihanje


STRUKTURA ORGANOFOSFATOV
Organofosfati so estri fosforne kisline ali njenih derivatov. Večina ima naslednjo splošno formulo:

R1 O (ali S)

P

R2 X

X:izstopajoča skupina, (leaving group) = kisla skupina (halogen, cianidi, tiocianat, fenoksi skupina..) Ta skupina je najbolj elektronegativna substituenta spojine, ki zapusti AchE-organofosfat kompleks v reakciji, ki jo klasificiramo kot nukleofilno substitucijo*. Za skupino X je značilno, da je kot anion najstabilnejša.Tendenco skupine, da izstopi kot anion, merimo v večini primerov s stabilnostjo ustrezne vodikove kisline z vodo.
Enačba: HX ŰH+ + X-
Bolj kot je stabilen anion X, več kisline disociira, kar pomeni, da je kislina močnejša. Izstopajoča skupina X, ki ustreza močnejši kislini, bo boljša izstopajoča skupina. To pomeni, da bo hitrost substitucije večja. Od tega je tudi odvisna toksičnost in uporabnost organofosfata. DFP (diizopropilfosfoflourudat: X je flour) hitreje reagira z AchE kot paration, ki ima vezan 4-nitrofenol, ker je HF (hidroflourova kislina) močnejša kislina kot 4-nitrofenol. DFP se je v II. svetovni vojni uporabljal kot bojni strup, paration pa se uporablja kot insekticid.

* V našem primeru je nukleofil encim AchE, ki zamenja na mestu substrata z nizko elektronsko gostoto (d+) najbolj elektronegativno substituento (skupina X). To mesto je atom fosforja v organofosfatu, ki je obkrožen z bolj elektronegativnimi atomi kot je sam, zato ga opisujemo kot elektrofilnega.

R1, R2:bazična skupina (alkil, ,alkoksi,amido skupine... ). Določa lipidotopnost, polarnost vezi P-X in stabilnost organofosfata. (Amino skupina je bolj stabilna od alkoksi skupine, zato so organofosfati z vezano amino skupino manj reaktivni). Zelo pomembna je dolžina alkilne skupine. Čim daljša je, tem bolj je organofosfat lipidotopen, kar pomeni, da lažje prehaja preko celične membrane in hematoencefalne bariere. Bolj lipidotopni organofosfati se tudi lažje absorbirajo skozi kožo in sluznice.

REAKCIJA ORGANOFOSFATOV Z ACH-ESTERAZO

Reakcija poteka v treh stopnjah
1) Encim in substrat je v ravnotežju z adsorpcijskim kompleksom
2) Nukleofilna substitucija (kislo skupino zamenja encim, ki ima vlogo nukleofila). Pride do fosforilacije esteraznega mesta (serinski ostanek) v aktivnem centru. Takšen encim ni zmožen vezave in hidrolize Ach , torej je inhibiran.
3) Hidroliza fosfolirirane AchE. Fosforilirane B-esteraze se hidrolizirajo zelo počasi, v nekaterih primerih prepočasi, da bi sploh lahko izmerili hitrost. Takšno reakcijo imenujemo psevdoireverzibilna (reakcija sicer poteka, vendar je zelo počasna). (shema 2)

Podobno poteka tudi reakcija AchE z Ach, vendar je hidroliza acetilirane AchE zelo hitra v primerjavi s hidrolizo fosforilirane AchE, saj poteče v že okrog 200 ms. (shema 1)

REAKCIJA FOSFORILIRANEGA ENCIMA Z OKSIMOM
Nekateri nukleofilni agensi, kot so na primer oksimi, reaktivirajo encim hitreje od spontane hidrolize. Oksim nukleofilno napade fosfor na fosforiliranem AchE. Oksim-fosfat se odcepi in zapusti regeneriran encim. V tem primeru je torej encim izstopajoča skupina. (shema 3)


PUSTI TRI CETRT STRANI PRAZNE!


DIAGNOSTIKA


Pri hudi akutni zastrupitvi je potrebno hitro ukrepati, zato diagnozo postavimo na osnovi kliničnih simptomov in znakov zastrupitve (npr:ogledovanje zenic),okoliščin v katerih najdemo bolnika in heteroanamneze. Diagnozo dokončno potrdimo z merjenjem aktivnosti ChE v eritrocitih in psevdo-ChE v plazmi.Čeprav aktivnost ChE pri zdravih ljudeh normalno variira, bo pri zastrupitvi vrednost aktivnosti ChE precej pod normalno vrednostjo (pod 50).
Vsi znaki in simptomi niso zmeraj nujno izraženi. Nekateri izmed njih so lahko prikriti zaradi aktivacije simpatikusa, ki nastopi v zvezi s strahom pri zastrupljencu; npr: bradikardija je pri lažje zastrupljenih lahko slabo izražena ali pa preide v tahikardijo, predvsem na račun povečanega simpatikotonusa.
Pri diagnostiki zastrupitve z organofosfati si lahko pri odraslih pomagamo z akronimom SLUD ( Salivation, Lacrimation, Urination, Defecation ). Pri mlajših otrocih ( starosti 3 leta in manj ) pa je težko ločevati med nehoteno defekacijo in mikcijo kot posledico zastrupitve in normalno razvojno pogojeno inkontinenco, solzenje pa je lahko posledica joka zaradi strahu in bolečin.
Pri zaužitju organofosfatov je lahko pri zastrupljencu prisoten zadah po topilih, v katerih so organofosfati raztopljeni , zlasti kadar gre za sredstva, ki se uporabljajo v kmetijstvu. Zadah utegne spominjati na ketoacidozo in kadar imamo opravka z komatoznim zastrupljencem nas lahko ta podobnost zavede v napačno diagnozo ( diabetična ketoacidoza in koma ), še zlasti, če si nismo ogledali zastrupljenčevih zenic.


ZDRAVLJENJE

1. PRVA POMOČ
Zastrupljenca moramo čim prej evakuirati iz kontaminiranega prostora in zagotoviti vitalne funkcije. Pri perkutani in inhalacijski zastrupitvi moramo čim prej odstraniti kontaminirano obleko in zastrupljenca čim prej temeljito umiti. Če je zastrupljenec strup zaužil, mu moramo izprati želodec, dati aktivno oglje in odvajala. Zaužiti strup se izloča tudi z znojem, zato moramo bolnike tudi med nadaljnim zdravljenjem večkrat temeljito umiti. Spremljajoče krče blažimo z Diazepamom ali Na-tiopentalom.

2. SIMPTOMATSKO ZDRAVLJENJE
Še pred prevozom v bolnišnico moramo zastrupljencu dati antidot atropin 2-4 mg intravensko, nato pa ponavljati v dozi 1 mg intravensko vsakih 5 minut do pojavljanja začetnih znakov atropinizacije (prenehanje bronhialne hipersekrecije, salivacije in midriaza).
Atropin deluje antagonistično na muskarinske receptorje, blaži znake povečanega tonusa parasimpatika, torej zmanjšuje bronhokonstrikcijo in prekomerno bronhialno sekrecijo, sekrecijo žlez slinavk in bradikardijo. Atropin pa ne deluje na nikotinske receptorje in zato nima vpliva na periferno muskulatorno hiperaktivnost in paralizo.

2. ETIOLOŠKO ZDRAVLJENJE
Za reaktivacijo acetilholinesteraze damo čim prej oksime (npr. pralidoksim, obidoksim klorid) v dozi 1 mg intravensko, nato vsakih 6 ur v enaki dozi do 48. ure po zaužitju strupa glede na klinično sliko in aktivnost acetilholinesteraze. Oksimi delujejo tako, da pospešijo defosforilacijo acetilholinesteraze. Vežejo se na fosfor organofosfata vezanega na serinski ostanek aktivnega centra acetilholinesteraze. Nastaneta oksim fosfat in regeneriran encim. Terapijo moramo spremljati z merjenjem nivoja aktivnosti acetilholinesteraze v serumu.
Fosforilirana acetilholinesteraza postane hitro nezmožna za reaktivacijo z oksimi. Pravimo, da se »stara«. Pri tem pride do odcepa ene alkilne skupine na organofosfatnem delu, vezanem na acetilholinesterazo, to pa spremeni obliko aktivnega centra in onemogoči reaktivacijo z oksimi.

SEM PRIDE SE ENA SLIKA!