1.Telomera

a)Struktura in naloga
Povprečna dolžina enega celičnega cikla traja približno 24 ur. V tem ciklu so zajete mitoza, G1 faza, S faza in G2 faza. Normalna človeška somatska celica pa je omejena na okoli 50 replikacij, po katerih pride v obdobje celične senilnosti(nahaja se v G1 fazi). V tej fazi je celica metabolično aktivna, konstantno raste in ne replicira svoje DNA. Za omejeno število delitev so odgovorne telomere, katerih dolžina se z delitvami zmanjšuje. Telomere so nukleoproteinski kompleksi, ki se ne morejo skrajšati preko neke svoje minimalne dolžine, zato delujejo kot varovalo zapisa na kromosomih. Če tega varovala ne bi bilo, bi se kromosomi še naprej skrajševali in sčasoma bi se izgubile informacije zapisane na kromosomih. Iz tega lahko sklepamo, da je dolžina telomer povezana s starostjo tkiv. Ne vsebujejo kodiranih sekvenc za proteine, ampak ščitijo konce kromosomov pred zlepljanjem v obroče in preprečujejo, da bi se povezale z drugimi molekulami DNA v jedru in bi tako nastali dvo- ali večsrediščni kromosomi. Če ne bi bilo telomer bi se tako formirali abnormalno oblikovani krosomi, ki bi se med mitozo prelomili, kar bi vodilo do poškodb genoma. Ob tem pa bi se aktivirale signalne točke v samem celičnem ciklu in bi tako celico usmerile v apoptozo.
Na 3` koncih so telomere bogate z gvaninom, na 5` pa s citozinom in tako pride zaradi privlaka med tema dvema baznima paroma do zavihanja konca in nastane tako imenovani T-zavoj. Obstajao določeni proteini, povezani z telomernimi konci DNA, ki naj bi pomagali oblikovati in vzdrževati ta zavoj.

b)Problem zaostajajoče verige
Ko se celica deli, se kromosomi kopirajo z encimom DNA polimerazo. Tu pa se pojavi problem, ker DNA polimeraza ne more sintetizirati skrajnega 5` konca zaostajajoče verige v replikacijskih vilicah. To si lahko predstavljamo kot kasetofon ki tudi ne more predstaviti skrajnih delov traku. Tudi če bi obstajal RNA primer za ta del, se ne bi mogel zamenjati z DNA, ker DNA polimeraza deluje le v smeri 5`→3`. Obstajati mora torej mehanizem za dopolnitev zaostajajoče verige, ker bi se v drugem primeru DNA molekule v vsakem replikacijskem krogu skrajšale za dolžino enega primerja, to je za 25-200 baznih parov.

c)Asimetrija kromosomskih koncev
Pri replikaciji DNA verige nastaneta dve telomeri (ena na glavni in ena na zaostajajoči), ki sta različni. Telomera glavne verige je bogata s citozinom, telomera zaostajajoče verige pa z gvaninom. Teoretično bi pričakovali, da bo zaradi “končno-replikacijskega problema” 3` konec nastal le na zaostajajoči verigi, vendar novejše raziskave kažejo da temu ni tako. Pri človeku naj bi imela glavna veriga relativno kratek, z gvaninom bogat 3` konec; 3` konec zaostajajoče verige pa naj bi bil dolg okoli 150-200 nukleotidov.

2.Telomeraza
a)Vloga
Ko prispe podvajanje DNA do konca kromosoma, bi morala DNA-primaza dodati RNA začetnik za zadnji Okazakijev fragment čisto na sam konec verige DNA, ki je matrica za sintezo zaostajajoče verige. Encim bi se namreč moral pritrditi na konec verige DNA in pomanjkanje prostora bi mu onemogočilo, da bi začel dodajati nukleotide na istem mestu. Ker tega ne more storiti, bi bil konec kromosoma nepopoln. Tako se konci kromosomov ne bi mogli podvojevati in bi se krajšali iz generacije v generacijo celic. Problem rešuje encim telomeraza, ki dodaja telomere na konce podvajajočih se kromosomov.

b)Aktivacija
Trenutno ni čisto jasno, ali telomeraza deluje na glavno ali na zaostajajočo verigo; izključeno ni niti, da lahko deluje na obe. Obstajata dva modela, ki pojasnjujeta vlogo dveh pomožnih protenov pri podaljševanju telomer: PRITEGNITVENI in AKTIVACIJSKI


Cdc13p, ki je vezan na telomero, privabi Est1 in le ta privabi preostale komponente, potrebne za delovanje telomeraze.
Telomeraza je vezana na telomere skozi ves celični cikel, vendar je večinoma neaktivna. Aktivira se le v pozni fazi S.




Človeška telomeraza je sestavljena iz dveh glavnih podenot:
-REVERZNE TRANSKRIPTAZE : (hTERT)-(proteinska komponenta),
-TELOMERAZNE RNA MATRICE : (hTR) ter
-DODATNIH PROTEINOV : Hsp90, p23, TEP-1

Hsp90 in p23 sta molekulska šaperona, ki pomagata pri sestavljanju podenot, potrebnih za aktiven telomerazni kompleks.
Telomerni substrati so kompleksi iz proteinov in DNA, ki kažejo asimetrijo med dvema koncema kromosoma.

MULTIMERNE DOMENE
Človeška telomeraza oblikuje visoko urejene multimere. Molekulska teža človeške telomeraze ustreza dimeru, vsak telomerazni kompleks vsebuje dve telomerazni RNA molekuli. Dva ločena katalitično neaktiva hTERT proteina lahko drug drugega komplementirata z namenom povrnitve katalitske sposobnosti. To imenujemo medpodenotna komplementacija. Ta komplementacija zahteva N-konec prve hTERT in C-terminalno domeno druge hTERT.

c)Modeli delovanja
Natančen mehanizem delovanja še ni odkrit, obstajajo pa tri možni modeli:




1.model
Po dodatku telomernega tandema(TTAGGG) se RNA matrica izklopi-postane inaktiven.







2.model
Matrica ene podenote je uporabljena za vezavo substrata, matrica druge podenote pa je tista, ki se prepiše med postopkom dodajanja tandema TTAGGG na 3 kromosomski konec. Pri tem modelu torej razlikujemo »DNA sidrišče«(prva podenota) in katalitično mesto (matrica druge podenote).





3.model
Obe podenoti v telomeraznem kompleksu sta aktivni in naj bi sočasno paralelno podaljšali dva ločena 3 telomerna konca.


SPLOŠNI MEHANIZEM DELOVANJA TELOMERAZ
Telomeraza podaljša kromosomske konce s ponavljajočo se reverzno transkripcijo svoje RNA matrice. Po dodatku vsake tandemske ponovitve, RNA matrica in telomerni substrat ponastavita relativni položaj v aktivnem mestu hTERT. Ob tem se lahko v nastajajočem produktu formirajo z gvaninom bogate sekundarne strukture. Aktivna mesta različnih telomeraznih multimer pri tem medsebojno sodelujejo.

d)Telomerazni reakcijski cikel

Sestavljen je iz štirih faz. Domnevano je, da se encimske lastnosti telomaraze med ciklom pojavljajo v dveh stanjih.
1.faza
V izhodiščnem stanju prosti 3 konec telomere in katalitična podenota hTERT nista povezana
2.faza
Bazno parjenje med končnim tandemom
3.faza
Podaljšanje telomere za en tandem(ena ponovitev TTAGGG) s pomočjo reverzne transkripcije
4.faza
Translokacija. Tu se morajo spremeniti lastnosti encima. Telomeraza pridobi lastnost, ki mu omogoči ločitev od substrata. To pomeni, da je encim bodisi v izhodiščnem stanju, bodisi stopi v fazo 2 in s tem podaljšanje za še en tandem.

d)Mehanizmi posameznih faz

1.MODULACIJA AFINITETE DO DNA SUBSTRATA
Z metodo photo-crosslinking assay je bilo odkrito, da obstajata dve vrsti stopnje disociacije med telomerazo in substratom; hitra in počasna.
Hitrost disociacije med substratom(telomera) in encimom(telomeraza) je odvisna od:
-zaporedja baznih parov na DNA
-količine prepisane RNA matrice (ob koncu prepisovanja se afiniteta encima do substrata zmanjša)
-količine nukleotida dGTP, ki se ob prepisovanju dodaja. Višje koncentracije pomenijo premik k hitrejšim stopnjam disociacije, pospeši pa se tudi hitrost dodajanja nukleotidov.

2.MEHANIZMI TRANSLOKACIJE
Prepisovanje RNA matrice poteka v 35 smeri. Ko se prepiše celotna matrica se DNA substrat spet posatvi na začetek RNA matrice, kar omogoča morebitni ponoven prepis matrice. Ta proces imenujemo translokacija.
Translokacija vključuje naslednje korake:
1. Prekinitev interakcij med baznimi pari v DNA-RNA hibridu. Prekinjenih mora biti maksimalno 8-10 baznih parov, kar pomeni, da je aktivacijska energija nižja, kot pa če bi bazni pari v DNA-RNA hibridu ostali povezani. Aktivacijska energija naj bi se znižala zaradi nastanka G-G lasnic in G-kvadripleksov v nastajajočem produktu. To so sekundarne G strukture, ki ne vplivajo na začetno vezavo substrata na encin in tudi ne na sintezo prve tandemske ponovitve.
2. Spremeni se pozicija RNA matrice relativno na aktivno mesto encima
3. Ponovna vzpostavitev interakcij med DNA-RNA baznimi pari na drugi strani(3)


3. Uporaba inhibitorjev telomeraz pri zdravljenju rakavih obolenj
Če pride v celici do mutacij, zaradi katerih se celica ne neha deliti, se njene telomere skrajšujejo še naprej in kmalu dosežejo kritično minimalno dolžino, ko se začne povečevati genomska nestabilnost. Začno se kopičiti kromosomske napake in celica vstopi v tako imenovano obdobje krize.
Iz obdobja krize ima celica dva izhoda:
a) zaradi prevelike akumulacije napak se vklopi mehanizem apoptoze (programirana celične smrt) in celica odmre.
b) V celici pride do določene mutacije, ki omogoči prenehanje skrajševanja telomer – deljenje in hkrati izognitev apoptozi. Celica postane nesmrtna, z nadaljnjo akumulacijo mutacij pa lahko pridobi maligne lastnosti.

INHIBICIJA JE USMERJENA NA VEČ RAVNI:
1.Preprečitev transkripcije hTERT mRNA (tako ne pride do translacije hTERT mRNA v protein hTERT, ki je ena izmed glavnih podenot telomeraznega kompleksa). V te namene se uporabljajo:
 ˝antisense˝ oligonukleotide, ki se vežejo na zaporedje DNA, ki obsegajo hTERT mRNA in tako preprečijo njeno ekspresijo.
 Hammerhead ribocime. Ribocimi so majhne katalitične RNA molekule, ki imajo tudi endonukleazno sposobnost. Vsebujejo neko ˝antisense˝ zaporedje, ki je usmerjeno proti svoji tarči, ki jo lahko nato izreže in tako onemogoči njen prepis. Ta mehanizem so s pridom uporabili pri epitelijskih celicah prsi, kjer je takšen ribocim odcepil hTERT mRNA, kar je inhibiralo delovanje telomeraze.
 Inhibicija delovanja transkripcijskih faktorjev , ki inducirajo transkripcijo hTERT mRNA. Eden izmed takih transkripcijskih faktorjev, je tedi C-Myc. Odkrite so bile spojine, ki inhibirajo C-Myc in s tem preprečili prepis mRNA, kar je inhibiralo encimsko delovanje telomeraze.
2. blokada vezave Hsp 90 in p23 s katalitično podenoto telomeraze, kar onemogoči formacijo aktivenga telomeraznega kompleksa. Za inhibicijo Hsp 90 se uporablja učinkovina imenovana geldanamycin.
3. direktna vezava sintetičnih molekul na različne komponente telomeraznega kompleksa (najpogosteje sta tarči hTERT in htr), kar povzroči izpad telomerazne funkcije. Te sintetične molekule delujejo torej kot nekakšno stikalo, ki ima sposobnost izklopa delovanje telomeraze.








Mehanizem inhibicije:

Tudi tukaj gre za kompetitivno inhibicijo telomerazne aktivnostI. Uporablja se kratke DNA ali RNA molekule, ki se vežejo na RNA matrico znotraj htr podenote.Tako hTERT ne more uporabiti RNA matrice za reverzno transkripcijo in ne pride do podaljšanja telomere.