ODGOVOR CELICE NA STRES

Simon Brmež

Pred 30 leti so biologi opazili, da se v vseh celicah, od preprostih bakterij do nevronov, ki so izpostavljene nenadnemu porastu temperature, poveča produkcija določenih molekul. Pojav so imenovali HEAT-SHOCK RESPONSE, odgovor na vročinski šok.

V svojih raziskavah so biologi uporabili sadno muho Drosophila melanogaster. Celice v njenih žlezah slinavkah vsebujejo kromosome, v katerih je normalna količina DNA tisočkrat pomnožena - orjaški kromosomi. Med razvojem muhe od embrija do odrasle oblike, se vzdolž orjaškega kromosoma določene regije izbočijo ali razširijo. To so pufi (puffs). Vsak puf je rezultat specifične spremembe v izražanju gena.
F.M. Rittosa (laboratorij za genetiko in biofiziko v Neaplju) je opazil, da se pri temperaturi, ki je rahlo višja od optimalne, potrebne za normalen razvoj, vzorec pufov pojavi minuto ali dve po zvišanju temperature. Pufi se širijo še 30 do 40 minut.
Leta 1974 sta Alfred Tissieres (univerza v Ženevi) in K. Mitchell (Kalifornija) ugotovila, da te z vročino povzročene pufe spremlja edinstven set proteinov, ki so jih poimenovali HEAT - SHOCK PROTEINS. Pufi predstavljajo mesto na DNA, kjer nastaja m-RNA, ki nosi genetsko informacijo za te proteine.

Ta edinstven set proteinov je bil predmet mnogih raziskav. Do leta 1970 so se kopičili dokazi o odgovoru na vročinski šok, do katerega pride v vseh celicah - bakterijah, kvasovkah, rastlinskih in živalskih celcah. Do njega pride tudi, če so celice izpostavljene težkim kovinam, alkoholu ali drugim metaboličnim toksinom.
Ker toliko različnih stimulusov povzroči podobne spremembe v izražanju genov, so raziskovalci pojav poimenovali STRESS RESPONSE - odgovaor na stres, spremljajoče proteine pa stresni proteini.
V naslednjih letih so znanstveniki uspeli izolirati gene, ki kodirajo stresne proteine v različnih organizmih. Prišli so do dveh nepričakovanih ugotovitev : 1. večina genov, ki kodira stresne proteine, si je izredno podobna v vseh organizmih. Npr.: HSP 70 (heat shock protein), najvišje
inducirani stresni protein je več kot 50\% identičen v bakterijah, kvasovkah in Drosophili. 2. veliko stresnih proteinov se izrazi tudi v normalnih in ne samo v poškodovanih celicah.

Leta 1980 je L. E. Hightower (univerza v Connecticutu) opazil, da večina agensov (visoka temperatura, različni toksini,...) povzroči denaturacijo proteinov. Kakršnakoli motnja proteinske strukture pa lahko vodi v izgubo biološke funkcije proteina. Prav tako je ugotovil, da akumulacija denaturiranih ali nepravilno zvitih proteinov povzroči odgovor na stres. Sklepal je, da stresni proteini nekako pospešijo identifikacijo in odstranitev denaturiranih proteinov iz poškodovane celice. To so v nekaj letih tudi potrdili. Injiciranje denaturiranih proteinov v živo celico je povzročilo stresni odziv.
Raziskave lastnosti stresnih proteinov so pokazale, da se po vročinskem šoku HSP 70 proteini zbirajo v jedrcu, kjer se sintetizirajo ribosomi, ki sintetizirajo proteine. Znano pa je bilo, da po vročinskem šoku celica preneha proizvajati ribosome in je jedrce polno denaturiranih ribosomalnih partiklov. Zato je Hugh R.B. Pelham (Cambridge) domneval, da HSP 70 nekako prepoznajo denaturirano obliko proteina in jo vrnejo v biološko aktivno obliko. Leta 1986 so on in njegovi sodelavci ugotovili, da je ena izmed oblik HSP 70 identična z BiP (immunoglobulin binding protein). BiP se veže na novo sintetizirane proteine, ko se le ti zvijejo v zrelo obliko. Če se proteini ne zvijejo pravilno, ostanejo vezani na BiP in se tam razgradijo. Zato celica takrat, ko se v njej nakopičijo nepravilno zviti proteini, proizvaja več BiP-a. BiP torej deluje kot nekakšen nadzornik kvalitete. Pravilno zvitim proteinom omogoči vstop v metabolično pot, zadrži pa tiste, ki se niso sposobni pravilno sestaviti.
Poleg HSP 70 obstaja še cela družina njemu sorodnih proteinov, ki imajo podobne lastnosti (velika afiniteta do ATP). C. Georgopoulus (Utah) in njegovi sodelavci so povzročili mutacijo na genih za stresna proteina groEL in groES. Na bakteriji se zato niso mogli razviti virusi, katerih razvoj je odvisen od gostitelja. Proteine, ki so podobni bakterijskim groEL in groES najdemo tudi v ratslinskih in živalskih celicah - HSP 10 in HSP 60. Opazili so jih le v mitohondrijih in kloroplastih, verjetno pa so tudi na ostalih intracelularnih kompartmentih. HSP 10 in HSP 60 sta nujno potrebna za pravilno zvijanje in sestavljanje proteinov. HSP 60 sestoji iz 7 membran, nakopičenih druga na drugo. Je kot nekakšna delovna mizica, kjer se proteini povežejo in dosežejo končno tridimenzionalno strukturo. Ta izredno dinamičen proces potrebuje energijo, ki je zagotovljena z razcepitvijo ATP in sodelovanjem HSP 10 molekul. Ko nov polipeptid pride iz ribosoma, je povezan s HSP 70, ki prepreči, da bi se prezgodaj zvil. Ko je njegova sinteza končana, preide na HSP 60, kjer poteka zvijanje in sestavljanje proteina.

Dognali so tudi, da se lahko denaturiran protein znova spontano zvije, če je povzročitelj denaturacije odstranjen To je pripeljalo do modela o samosestavi proteinov, za katerega je C.B. Anfisen leta 1972 dobil Nobelovo nagrado. Glede na ta model, je ta proces odvisen le sekvence amino kislin v polopeptidu. Hidrofilne AK se nahajajo na površini proteina, hidrofobne pa v notranjosti. Hidrofilne AK zavarujejo protein pred vodnim celičnim okoljem. Do zvijanja proteina pride zaradi termodinamskih sil.
Zdaj večina znanstvenikov domneva, da je za zvitje proteinov potrebna še aktivnost ostalih celičnih komponent, vključno s HSP 60 in HSP 70 stresnimi proteini. Na stresne proteine so začeli gledati kot na nekakšne “gardedame”, ki zagotovijo, da se proteini zvijejo hitro in z visoko natančnostjo.

ZAKAJ SE STRESNI PROTEINI V ČASU STRESA BOLJ IZRAZIJO?
Višja temperatura, ki povzroči odziv celice na stres, denaturira nekaj proteinov v notranjosti celice. Ti predstavljajo tarče, na katere se vežeta HSP 60 in HSP 70. Čez čas nivo razpoložljivih HSP 60 in HSP 70 pade in začne omejevati celico v produciranju proteinov. To celica nekako zazna in odgovori z naraščajočo sintezo novih stresnih proteinov.
Če vročina ali kakšen drug škodljiv vpliv povzroči ireverzibilno denaturacijo celičnih proteinov, jih mora celica nadomestiti. Pri tem pomagajo stresni proteini, ki olajšajo sintezo in sestavljanje novih proteinov.Razen tega lahko visok nivo stresnih proteinov prepreči denaturacijo ostalih proteinov.

STRESNI PROTEINI VPLIVAJO NA MALIGNOST CELIC
Znansveniki, ki se ukvarjajo z rakom, so v začetku 80 let ugotavljali, kako virus inficira celico in povzroči raka. V primeru Rous sarkoma so ugotovili, da se encim, ki ga producira virusni gen in vpliva na ostale proteine, ki regulirajo celično rast, pp60src, veže s proteinom HSP 90 in P50. Ko se pp60src v citoplazmi spoji s P50 in HSP 90, je encimsko neaktiven. Trio molekul se prenese na membrano, pri tem P50 in HSP 90 odpadeta in encim (vložen v membrani) postane aktiven. To pomeni, da lahko povzroči razvoj malignega stanja.

VPLIV STRESNIH PROTEINOV NA RECEPTORJE STEROIDNIH HORMONOV
Nekatere raziskave so pokazale zvezo med HSP 90 in receptorji steroidnih hormonov. Steroidni hormoni sodelujejo pri pomembnih življenskih procesih: glukokortikoidi pomagajo preprečiti vnetje, imajo vlogo pri spolni diferenciaciji in razvoju.
Ko se steroidni receptor veže s steroidnim hormonom, postane receptor zmožen interakcije z DNA in oba lahko aktivirata ali preprečita izražanje določenih genov. V odsotnosti hormona se receptor poveže s celičnimi proteini, tudi s HSP 90 in to ga ohrani v neaktivni obliki. Torej HSP 90 tudi tukaj regulira biloško aktivnost steroidnih receptorjev.

REALIZACIJA PRAKTIČNE UPORABE STRESNEGA ODZIVA
Pri pacientih, ki so doživeli srčni napad ali možgansko kap, je krvni obtok skozi srce in možgane ogrožen. To stanje imenujemo ishemija. Zaradi zmanjšanega pritoka kisika prizadet organ ne more ohraniti zadosten nivo ATP, zato nekateri nujni metabolični procesi ne morejo potekati. Ko se krvni pretok ponovno vzpostavi, je organ spet hitro prekrvavljen, kar je tudi lahko škodljivo. Velikokrat namreč nastanejo visoko reaktivni prosti radikali, ki lahko povzročijo dodatno škodo. Znanstveniki so opazovali stresni odgovor v obeh primerih (v srcu in možganih). Celice, ki producirajo več stresnih proteinov, imajo večje možnosti da preživijo. Torej lahko višji nivo stresnih proteinov poskrbi za dodatno zaščito poškodovanega tkiva oz. organa. Takšen pristop lahko zmanjša poškodbe organa zaradi ishemije med kirurškim posegom ali pa ščiti izolirane organe namenjene transplantaciji.

STRESNI PROTEINI V IMUNOLOGIJI
Infekcijske bolezni, kot so TBC, malarija, gobavost, povzročajo bakterije ali parazitski organizmi. Stresni proteini, ki jih ti organizmi proizvajajo, so tarče, ki jih imunski sistem spozna in tako uniči napadalca.
Možnost obstaja, da stresne proteine različnih patogenov, ki jih producirajo v laboratorijih, lahko uporabijo kot vakcino za preprečitev mikrobioloških infekcij.
Povezani z virusnimi proteini lahko stresni proteini mikroorganizmov zvišajo obrambo proti virusnim infekcijam.
Prisotnost antiteles proti stresnim proteinom mikroorganizmov je lahko koristna v klinični diagnostiki. Bakterija Chlamidya trachomatis povzroča veliko bolezni, npr.: trahom (vzrok slepote), vnetja medeničnih organov (vzrok neplodnosti pri ženskah). Infekcija sproži nastanek protiteles proti bakterijskim antigenom, med katerimi so tudi stresni proteini. Takšen odgovor je lahko učinkovit in prepreči infekcijo ali pa je preveč agresiven in povzroči poškodbe okolnega tkiva (pri ponavljajočih infekcijah).
R.S.Stephenson (San Francisco) in njegovi sodelavci so opazovali ženske z ekstrauterino nosečnostjo. 80\% teh žensk je imelo zvišan nivo antiteles proti stresnim proteinom Chlamydie. Merjenje protiteles pomaga ugotoviti riziko ekstrauterine nosečnosti.
Stresni proteini vplivajo na avtoimuna obolenja: revmatoidni artritis, sistemski lupus eritromatozus.Večina teh bolezni nastane, če se imunski sistem obrne proti antigenom v zdravem tkivu.Pri teh boleznih so opazili protitelesa proti lastnim stresnim proteinom pacienta.To pomaga tako pri diagnostiki kot tudi pri zdravljenju.

Kasnejše raziskave so pokazale, da je HSP 70 po strukturi in funkciji nenavadno podoben histokompatibilnim proteinom. Don C. Willey (Harward) je določil tridimenzionalno strukturo histokompatibilnih proteinov prvega razreda. Imajo žep ali brazdo, ki se lahko veže z različnimi antigenskimi peptidi. Računalniški model je pokazal, da ima tudi HSP 70 podobno strukturo s predelom, na katerega se lahko veže peptid.Prav tako nekaj genov, ki kodirajo HSP 70, leži blizu genov za histokompatibilne proteine.
Vsa opazovanja torej kažejo, da so stresni proteini celostna komponenta imunskega sistema.

ZDRAVLJENJE RAKA
Odziv celice na stres se lahko izkaže koristen pri zdravljenju raka. Tumorji so bolj občutljivi na povišanje temperature kot normalna tkiva in ta lastnost je lahko potencialna možnost zdravljenja.
Lahko pa je odziv na stres tudi ovira, saj se pri terapiji sproščajo v celici stresni proteini, ki dajejo tumorski celici dodatno zaščito. Tako lahko tumor postane tudi odpornejši.

UPORABA V TOKSILOGIJI
Sprememba nivoja stresnih proteinov, predvsem tistih, ki nastanejo v prizadetih celicah, je lahko koristna pri določitvi strupenosti zdravil, kozmetike...
S tehnologijo rekombinantne DNA so raziskovalci dobili linijo celic, ki naj bi bila zaslon za biološka tveganja. DNA v teh celicah, ki nadzoruje aktivnost genov za proteine, je povezana z genom, ki kodira encim na primer beta - galaktozidaza.Če pride do metaboličnega šoka, pri katerem naraste nivo stresnih proteinov, tvorijo celice tudi ta reporterski encim, ki ga je lahko odkriti. Količina beta - galaktozidaze se lahko meri s kemičnim substratom. Če je reporterski encim prisoten, se celica obarva modro po dokazovanju. Intenziteta barve je odvisna od koncentracije encima.

ONESNAŽEVALCI OKOLJA POVZROČAJO STRESNI ODZIV
Veliko onesnaževalcev okolja povzroča stresni odgovor. Znanstveniki so razvili transgenetsko glisto, kjer je gen reporter za beta - galaktozidazo pod kontrolo promotorja za stresne proteine. Če to glisto izpostavijo različnim onesnaževalcem okolja, se izrazi reporterski encim in se ob dokazovanju obarva modro.

Še pred tridesetimi leti so mislili, da je odziv celice na stres posebnost pri sadni muhi. Danes pa vemo, da stresni proteini sodelujejo pri bistvenih celičnih procesih, da je možna njihova uporaba na raznih področjih medicine, toksikologije,... Kljub temu pa je razumevanje stresnih proteinov še nepopolno.