HUMANA GENSKA TERAPIJA


1. UVOD

Genske bolezni so že od časa odkrivanja njihove molekularne etiologije in patogeneze "imune" na klasično vzročno terapijo. Ocenjeno je, da ima 50\% spontanih abortusov v prvih mesecih gestacije dokazljivo kromosomsko abnormalnost. Okrog 1\% novorojenih otrok ima večjo koromosomsko abnormalnost, 5\% oseb, mlajših od 25 let razvije resno bolezen z karakteristično gensko komponento.
Dedne bolezni lahko v grobem razdelimo na monogenske, multifaktorske (okolje in mutacija), spolno vezane. Pri vseh gre v principu za manjšo ali večjo napako (mutacijo) v kodirajoči DNA sekvenci. Rekombinantna DNA tehnologija, razvita v zadnjih dveh desteletjih se je pokazala kot edina metoda, ki se lahko aplicira v vzročnem tretiranju genskih bolezni.

V splošnem, gre za vnašanje zdravega, rekombiniranega gena namesto defektnega, v prizadeto celično populacijo. Pri tem smo omejeni z načinom vnosa, s tipom celic (v poštev zaenkrat pridejo le somatske celice, ki so lahko dostopne, hitro rastejo v kulturi in jih je mogoče reimplantirati : kostni mozeg, fibroblasti, poskusi se delajo tudi na drugih tkivih, npr. jetra, epitelij, keratinociti...)

Pri izražanju rekombinantnega gena je potrebno :

- da se dosežejo fiziološke koncentracije produkta
- da se zagotovi integracija v točno določeno, tarčno celično populacijo
- da se izognemo imunološki inkompatibilnosti produkta
- da zagotovimo integracijo klonirane DNA na lokus na katerem ne bo povzročila okvare drugega gena (izognitev t.i. insercijskim mutagenom)
- da na rekombinantnem genu vgradimo lastne kontrolne mehanizme izražanja (promotor, enhancer), pokazalo se je namreč tudi to, da če rekombinirani gen ne vsebuje intronov, ne dosežemo fizioloških koncentracij produkta.

2. HOMOLOGNA REKOMBINACIJA - METODE

To je proces, pri katerem pride do interakcije med dvema homolognima DNA sekvencama. rezultat tega je nova rekombinantna sekvenca, nastala s kombiniranjem parentalnih DNA. Ta vrsta rekombinacije je koristna in pomembna v živih bitjih in pri raziskavah, kjer poskušamo zamenjati nefunkcionalni gen z zdravim, na tem bazira humana genska terapija (HGT).

Homologna rekombinacija praviloma nastane:

- med dvema DNA sekvencama z visoko stopnjo homologije
- med dvema nehomolognima sekvencama, ki sta omejeni z homolognimi odseki, pri točkovnih mutacijah stopnja homologije ponavadi ni omejujoč faktor

Eksogena DNA, ki se konstruira posebej za potrebe homologne rekombinacije se imenuje vektorska DNA.

Pogostost dejanske rekombinacije vektorske DNA vnešene v celico je odvisna od:

- načina vnosa (mikroinjekcija, 10-20\%, elektroporacija 0,1-1\%...)
- oblike, v kateri se vnaša v celico (linearna oblika se bolj uspešno rekombinira kot krožna)

Obstaja več metod, s pomočjo katerih vnašamo v sesalske celice v kulturi fragmente tuje DNA :

1.) transfekcija - celice v kulturi spontano inkorporirajo fragmente DNA z zelo nizko frekvenco. To frekvenco lahko povečamo z :
- fragmentiranjem prečiščene DNA na odseke, dolge 30-50 tisoč baznih parov v raztopini fosfatnega pufra
- raztopino precipitiramo z kalcijevim kloridom
- na celico apliciramo močno el. polje, ki spremeni prepustnost membrane (elektroporacija)

2.) mikroinjekcija - predstavlja direkten vnos eksogene DNA v celični nukleus, njena pomanjkljivost pa je, da se obdeluje vsako celico posebej, zato je zelo počasna in zamudna.

3.) infekcija celice z defektnim retrovirusom - retrovirusni genom je sestavljen iz petih osnovnih delov:
- ENV gen, ki kodira proteine ovojnice,
- GAG (group specific antigen) kodira proteine virusnega jedra
- LTR (long terminal repeat), ki usmerja integracijo virusnega v celični genom,
- POL gen, ki kodira reverzno transkriptazo in ligazo,
- PSI (y) sekvenca, ki kontrolira pakiranje virusne RNA v partikel.

Defektni retrovirus je virus, v katerem smo s tujo DNA nadomestili ENV, GAG in POL gene. Da bi se tak rekombinantni virus lahko repliciral, rabi "helper" virus, ki ima POL gen, ne pa PSI sekvence. tako v celici repliciramo rekombinantni vektor in z njimi inficiramo tarčne celice. Opisana tehnika je lahko nevarna zaradi naključnega integriranja v celični genom ali zaradi celične rekombinacije defektnega virusa z drugim virusom in povrnitvijo patogenosti.

4.) sesalski artificielni kromosomi (MAC) - pred kratkim so odkrili, da v sesalskem genomu obstajajo t.i. LRCE (long range controlling elements) sekvence, katere pri inkomponiranju v transgenično DNA omogočijo njeno popolno izražanje preko zmožnosti vezave tkivno specifičnih transkripcijskih faktorjev in enhancerjev. MAC je velika DNA sekvenca, ki vsebuje rekombinirani gen, lastni promotor in enhancer, LRCE's centromero in telomero, ki omogočata, da se v celici dolgo obdrži in replicira. V celico se vnese na razne načine : s pomočjo liposomov, kationskih lipidov, z receptorsko posredovano endocitozo DNA, pakirane v virusno ovojnico.

3. KLINIČNE APLIKACIJE GENSKE TERAPIJE

Prvi poskusi vsaditve eksogene DNA zaradi terapevtskih razlogov so bili izvedeni na hematopoetskih matičnih celicah v kulturi in to pri bolnikih z boleznijo imenovano SCID (severe combined imunodefficency diseases), ki je avtosomno recesivna dedna bolezen in je pri 40\% bolnikov karakterizirana z mutacijo na genu za encim adenozin deaminaza (ADA). Pomanjkanje tega encima pripelje do kopičenja deoksiadenozina in njegovih derivatov, ki so zelo toksični za nezrele T-limfocite. Otroci s to boleznijo so dovzetni za oportunistične infekcije in brez transplantacije kostnega mozga ne preživijo več kot eno leto.
Bolezen so uspešno tretirali z ekstrakcijo matičnih celic kostnega mozga, inficiranjem celic z retrovirusom, v katerem je rekombiniran ADA gen v kulturi in z implantacijo teh celic nazaj v bolnikov kostni mozeg.
Razen SCID sindroma so s podobnim načinom genske terapije zdravili cistično fibrozo, bolezen, pri kateri je okvarjen gen za CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), protein, ki je funkcionalno kloridni kanalček v epitelijih dihal in eksokrinih žlez.
Prav tako so poskusili zmanjšati deficit določenega serumskega proteina (npr. insulin) z vgrajevanjem rekombinantnega gena za ta protein v druge celice (keratinociti, fibroblasti...), njihovim razmnoževanjem v kulturi in reimplantacijo.
Zaključimo lahko s tem, da je genska terapija, čeprav nova in zaenkrat eksperimentalna disciplina, v prihodnosti veliko upanje za paciente z dednimi boleznimi. Dodamo lahko tudi to, da danes na svetu živi več kot 200 bolnikov, ki so preživeli svoje neozdravljive bolezni, prav zaradi genske terapije.




4. OBETI ali ZGODBICA ZA LAHKO NOČ

Kot dodatek tej predstavitvi genske terapije lahko razvijemo še eno zgodbico, za katero pa sploh ni nujno, da bi ostala le zgodbica, oz. je velika verjetnost da se uresniči.
Poznane so vse glavne lastnosti retrovirusov, značilno za njih je predvsem to, da imajo do potankosti razvit "program" vgrajevanja svoje RNA v genom celice. Za to je odgovornih nekaj encimov, ki jih virusi nosijo s sabo - reverzna transkriptaza, ligaza in proteaza, ki to omogočajo. Ena najhujših bolezni, pri katerih vzrok tiči ravno pri teh virusih je kuga 20. stoletja, AIDS, ki jo povzroča virus HIV. Z dobrim poznavanjem zgradbe prej omenjenih encimov ne bo težko zgraditi spojine, proteina oz. encima, ki bi bil sposoben te encime inhibirati oz. razgraditi. In če bi v trenutku okužbe z virusem AIDS-a v potek dogajanja vključili še en takoimenovan "antivirusni virus", ki bi nosil "program" za take ubijalske spojine, bi lahko povsem preprečili patogenost virusa HIV. Težava nastopi, ker je virus HIV lahko že vgradil svojo sekvenco v celični genom. Zato bi bilo lahko več rešitev - npr. da bi "virus ubijalec" kodiral tudi protein, ki bi zaustavil izvajanje vriusnih genov, oz. da bi jih preprosto izrezal. Po drugi strani pa je možno, da bi celice "cepili" s temi inhibitornimi molekulami, oz. "programom" za njihovo izdelavo še pred okužbo s HIV-om, tako da bi celice, v tem primeru imunskega sistema, že imele odlično orožje v primeru prave okužbe. In kar je najbolj noro pri vsem tem, je, da bi za dosego celic, ki jih napade HIV uporabili kar virus HIV-a samega, vendarle, v nepatogeni varianti. Slabost tega je edinole, da so potemtakem bolniki, ki so že zboleli za AIDS-om, odpisani. Eno je gotovo, genska terapija je največja možnost za zdravljenje tudi negenetskih obolenj, drugo pa je potem etična sprejemljivost takega početja, kajti obstaja tudi možnosti, da bi se znanstveniki spomnili in sprojektirali celični mehanizem, ki bi npr. 100 krat povečal moč imunskega sistema, in v končni fazi, bi zadeva lahko postala tudi zelo komercialna, ko bi bodoča starša prišla v bolnišnico ali kar v delavnico in naročila otroka s takimi in takimi očmi, nosom, superatletskimi preformancami in življensko dobo 200 let.
Iz tega lahko potegnemo zaključek, da je genska terapija v vsej svoji veličastnosti lahko tudi precej nevarna tehnika, ki bo, ko bo znanje dovolj obsežno in metode dovolj izpopolnjene, postala predmet špekulacij in umazanega početja.



MIREJ ŠTAMBUK in ARTUR ŠVARC, 1996















literatura:
- WATSON J.D. - HOPKINS N.M. - ROBERTS J.W. - STEITZ J.A : Molecular biology of the gene, B.Cummings publishing CO., 1994
- LEHNINGER - NELSON - COX : Principles of Biochemistry, Worth publ. 1994
- LOTRAN - KUMAR - ROBBINS : Pathologic Basis of Disease, W.B. Sanders Co., 1994
- SIKORA - GLORIOSO - WILLIAMSON - FRIEDMANN : Gene therapy, Jan. 1994; The MacMillan Press ltd., 1994