(pdf)
Proteomika bolezni
Avtor: Jure Triglav
Mentorica: doc. dr. Tea Lanišnik Rižner
Vsebina
Povzetek...................................................................................................................1
Kaj sploh je proteomika............................................................................................2
Zakaj proteomika.....................................................................................................2
Katere tehnike uporabljamo......................................................................................2
Dvodimenzionalna gelska elektroforeza....................................................................2
DNA mikromreže...................................................................................................4
Proteinske mikromreže...........................................................................................5
Masna spektrometrija.............................................................................................6
Do katerih spoznanj smo prišli in s katero tehniko.....................................................6
Levkemija – 2D PAGE............................................................................................6
Bolezni srca – 2D PAGE........................................................................................6
Karcinom požiralnika – 2D PAGE – DIGE...............................................................7
Rak na dojkah – DNA mikromreže in 2D PAGE......................................................7
Rak na prostati – Proteinske mikromreže................................................................7
Zaključek...................................................................................................................7
Literatura..................................................................................................................7
Povzetek
Proteomika je hitro razvijajoča se veja biokemije, ki proučuje proteom – vse proteine v nekem sistemu (na ravni celice, tkiva, ali celotnega organizma). Za preučevanje proteinov v proteomu uporabljamo različne metode, ki so šele pred kratkim bile preizkušene v aplikativni znanosti. Te metode so: 2D PAGE (dvodimenzionalna poliakrilamidna gelska elektroforeza – sicer so jo iznašli leta 1975, ampak je šele v zadnjem času pridobila na veljavi v praksi – deluje na principu ločevanja po izoelektrični točki na eni osi, in molekulski masi na drugi osi), DNA mikromreže (deluje s pomočjo hibridizacija in vezave komplementarnih baz) ter proteinske mikromreže (vezava proteinov na antigene specifične za te proteine, vezava protein-protein za raziskavo proteinskih kompleksov in vezava protein-ligand) Pridobiva tako »ugled« kot tudi finančno podporo industrije in kliničnih znanosti. Najbolj so interesantni prav klinični vidiki proteomike – uporabna je namreč za natančne in hitre diagnoze, razvoj visoko-specifičnih zdravil ter ugotavljanje sekvence in povezave proteinov in njihov vpliv na organizme. Celotna proteomika je zaenkrat še zelo v povojih in ima še marsikatero težavo, ki pa jih bodo s časom zagotovo premostili. Ker so proteini bistveni gradnik celic in organizmov (več kot 50 suhe celične mase sestavljajo proteini), smo lahko prepričani, da je proteomika zelo perspektivna veja znanosti.
1
Kaj sploh je proteomika
Proteomika je veja biokemije, ki se ukvarja s proučevanjem celotnih sistemov proteinov – kateri proteini sestavljajo sistem in iz katerih aminokislin so zgrajeni, kakšne metabolične in signalne povezave tvorijo itn.
Zakaj proteomika
Odkar so leta 2003 v okviru HGP (Human Genome Project) po trinajstih letih dela dokončno sekvencirali človeški genom, so vrata raziskavam proteinov na široko odprta. Proteomika se smatra za naslednji korak biološke znanosti – naprednejša in bolj zahtevna znanstvena veja v primerjavi z genomiko.
Cilj raziskav na tem področju je aplikativna uporaba znanstvenih dognanj za boljše razumevanje patoloških oz. bolezenskih stanj – razvoj biomarkerjev za lažje in hitrejše prepoznavanje bolezni in pospešenje razvoja visoko-specifičnih zdravil. Zanimivost in tudi komercialni potencial tega področja ustvarja veliko priložnosti, kot tudi izzivov za iznajdbo hitrih in občutljivih metod potrebnih za različne študije povezane s proteomiko bolezni.
Katere tehnike uporabljamo
Dvodimenzionalna gelska elektroforeza
Od zgodnjih let proteomike pa do nedavnega so se za profiliranje ekspresije proteinov v nekem patološkem stanju posluževali tehnike dvodimenzionalne poliakrilamidne gelske elektroforeze (2D PAGE [4]), ki se ji je kasneje pridružila tudi masna spektrometrija (»Mass spectrometry« [5]).
Dvodimenzionalna gelska elektroforeza je tehnika za ločevanje proteinov po dveh kriterijih hkrati:
1. po izoelektrični točki
2. molekulski masi.
Poteka v dveh korakih:
1. najprej naredimo izoelektrično fokusiranje v prvem gelu, ki je pripravljen tako, da vsebuje linearni pH gradient - tako ločimo proteine glede na izoelektrično točko.
Slika 1 – Izoelektrično fokusiranje - ločevanje glede na izoelektrično točko (pI)
2. prvi gel nato položimo na drugega (navadni SDS PAGE gel) in ponovno naredimo elektroforezo ter s tem ločimo proteine še glede na molekulsko maso.
2
Slika 2 - Gelska elektroforeza - ločevanje glede na molekulsko maso
Slika 3 - 2D PAGE - Dvodimenzionalna gelska elektroforeza
Večina raziskav z uporabo dvodimenzio-nalne gelske elektroforeze se je izvajala tako, da so na tkivu, celični kulturi ali biološki tekočini, uporabili kemijski koktajl, ki je »utekočinil« celotni vzorec.
Na tem vzorcu so nato naredili 2D PAGE analizo, katere rezultat so ponavadi še kontrastirali s srebrenjem, in na ta način
Slika 4 - Rezultat 2D PAGE z identifici-ranimi in označenimi proteini
ločili posamezne proteine od ostalih snovi in drugih proteinov.
Sčasoma so znanstveniki ugotovili, da ta metoda zaradi prikaza samo tistih proteinov, katerih delež v vzorcu je relativno velik, ni zadosti natančna za poglobljene raziskave.
Deloma lahko ta problem omilimo z uporabo »zoom« gelov – vzorec najprej na grobo profiliramo glede na pI, nato pa vsak delec vzorca, ki ustreza nekemu določenemu razponu pI dodatno profiliramo z visoko ločljivostjo z uporabo dvodimenzionalne gelske elektroforeze. Na ta način izboljšamo možnosti za odkrivanje proteinov, ki jih v vzorcu ni veliko.
Uporabnost 2D PAGE je izboljšala tudi DIGE (Differential in-gel electrophoresis) tehnika – diferencialna elektroforeza – s katero lahko na istem gelu primerjamo dva različna vzorca, ki sta obarvana s specifičnimi fluorescentnimi barvili.
Prav tako lahko ločljivost analize izboljšamo tako, da ne opazujemo celotnega proteoma, marveč samo del tega – sub-proteom.
Vsi ti dodatki in izboljšave 2D PAGE pa imajo svoje slabe strani – v večini primerov ti postopki vzamejo veliko več
3
časa in so tako za določene analize preprosto prepočasni, še posebej za klinične namene, kjer je tudi količina vzorca ponavadi omejena.
DNA mikromreže
Zaradi potreb po raziskavah z večjo specifičnostjo, večjo občutljivostjo in večjo prepustnostjo so razvili tehniko, ki temelji na ujemanju in vezavi komplementarne DNA vzorca in standarda.
Slika 5 - Priprava DNA mikromreže s pomočjo fotolitografije
Fotolitografija – ta tehnika za pripravo mikromreže deluje na principu nukleotid-nih prekurzorjev, ki jih natančno aktivira svetloba. Računalnik je programiran za tvorbo določenih oligonukleotidnih zaporedij v določeni točki mikromreže. Površino mikromreže spirajo z nukleotidi, ki se nato pod vplivom svetlobe vežejo na nukleotidno zaporedje določene osvetlje-ne točke. Pri vsakem nanosu se veže le en nukleotid, kar omogoča natančno izgradnjo zaporedij.
Slika 6 - Potek analize
Po tem ko pripravimo DNA mikromrežo, jo lahko »preizkusimo« z fluorescentno označenimi nukleinskimi kislinami. V tem primeru (Slika 6) smo zbrali mRNA vzorce žabjih celic v dveh različnih trenutkih v razvoju živali. Ta mRNA
4
zaporedja nato spremenimo v cDNA fluorescentno označene molekule, ki se nato vežejo z komplementarnimi zaporedji v točkah mikromreže.
Zelena barva pomeni, da je določenih mRNA zaporedij več v enoceličnem stadiju razvoja žabe; rdeča pomeni, da se več mRNA zaporedja specifičnega za to točko mikromreže pojavlja v kasnejšem razvoju; in rumena – v ekspresiji gena v teh dveh stadijih ni razlike.)
Proteinske mikromreže
Čeprav so DNA mikromreže radikalno spremenile raziskave funkcionalne genomike, je za bolezenske raziskave potreben drugačen pristop. Z uporabo DNA mikromrež namreč dobimo le podatek o količini mRNA molekul, ki pa ni v direktni povezavi s številom oz. vrsto proteinov v celici. Proteini se lahko tudi post-translacijsko spremenijo, kar se prav tako ne odraža v količini RNA. Pri bolezenskih raziskavah pa nas ponavadi zanima prav to – do kakšnih sprememb proteina pride, kako se spremenijo količine proteinov in kako proteini vplivajo drug na drugega ter ostale molekule.
Slika 7 - Različni pristopi k analizi proteinov
Trenutno uporabljamo pet različnih načinov oz. strategij v proteinskih mikromrežah. Na shemi (Slika 7) so prikazane tri(a,b,c) od teh:
a) »Sendvič« tehnika – na protitelesa, ki so imobilizirana na trdni podlagi, se vežejo primarni proteini – te nato zaznamo z uporabo markiranih sekundarnih protiteles
b) Ujetje antigena – Protitelesa so znova imobilizirana na trdni podlagi – na njih se vežejo markirani proteini
c) Direktna zaznava – pri tem načinu so imobilizirani proteini, na njih se vežejo markirana protitelesa
d) Protein-protein – proteini so kovalentno pritrjeni na podlago (npr. na steklo), na njih se vežejo markirani proteini
e) Protein-ligand – proteini so pritrjeni na podlago – na njih se vežejo markirani ligandi
Slika 8 - Možni zapleti
Kot vsi načini raziskovanja, imajo tudi proteinske mikromreže svoje slabe strani. Predvsem se znajo zadeve zaplesti, če je protein vključen v proteinske komplekse (Slika 8).
5
Masna spektrometrija
Slika 9 – Osnovna zgradba masnega spektro-metra
Masna spektrometrija je način ločevanja ionov glede na njihov količnik m/z (masa na naboj) S pomočjo masne analize proteina lahko ugotovimo njegovo sekvenco in ga identificiramo.
Masni spektrometer ponavadi sestoji iz treh delov – iz ionizatorja, analizatorja in detektorja (Slika 9). V ionizatorju delci dobijo naboj, zaradi katerega se potem v analizatorju odklonijo, kar na koncu zazna detektor. V kombinaciji z 2D PAGE lahko tako, da iz »pike« na gelu 2D PAGE vzamemo vzorec in ga analiziramo v masnem spektrometru, ugotovimo za kateri protein gre.
Slika 10 – Masna spektrometrija – mišji možgani
(Računalniško obdelani podatki pridobljeni z masno spektrometrijo – prikazani na petnajstih slikah, kjer vsaka predstavlja količino proteina z navedenim m/z količnikom (masa na naboj) – Zanimiva je primerjava signala proteina z m/z 5.631 in signala proteina z m/z 18.388, ki sta skoraj obratna.)
Poznamo več vrst masnih spektrometrij [5], a za potrebe proteomike so najbolj primerne naslednje:
1. ESI-MS (Electrospray ionization mass spectrometer)
2. MALDI-MS (Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)
3. Tandem MS
Do katerih spoznanj smo prišli in s katero tehniko
Levkemija – 2D PAGE
Ne glede na to, kako relativno nenatančna in počasna je 2D PAGE, so z njo že dolgo pred iznajdbo DNA mikromrež ločili in klasificirali različne tipe levkemije. [6,7]
Bolezni srca – 2D PAGE
Prav tako so z dvodimenzionalno gelsko elektroforezo preučili (oz. še preučujejo) korelacijo med bolezenskimi stanji srca (dilatacijska kardiomiopatija) in določenimi proteini.
Slika 11 – Proteini in njihov delež v bolnem tkivu (DCM), v primerjavi z zdravim tkivom (CONTROL) prisoten v mio-kardiju – znak dilatacijske kardiomiopatije
6
Karcinom požiralnika – 2D PAGE – DIGE
S DIGE primerjavo rakavih in normalnih celic požiralnika so ugotovili, da je veliko proteinov v rakavih celicah izraženih v drugačnih deležih, kot v zdravi celici.
Rak na dojkah – DNA mikromreže in 2D PAGE
Slika 12 – 2D PAGE analiza kaže na DCIS (duktalni karcinom in situ), kar potrjuje tudi IHC (imunohistokemijska preiskava)
Z uporabo DNA mikromrež so ugotovili in klasificirali več vrst raka na dojkah, kar je potrdila tudi kasnejša analiza faktorja preživetja posameznih skupin žensk z določeno vrsto raka. Vse ženske so se zdravile na enak način, faktor preživetja pa se je med posameznimi skupinami zelo spreminjal in je v veliki meri bil odvisen le od vrste raka.
Rak na prostati – Proteinske mikromreže
Za rak na prostati sicer že obstaja specifičen antigen (PSA – Prostate Specific Antigen), ki se uporablja v diagnozi, ampak ni zanesljiv. Predvsem v tem smislu, da na podlagi testov s PSA sklepamo, da pacient ima raka – dejansko pa ga nima. Pred kratkim pa so s pomočjo proteinskih mikromrež odkrili encim -metilacil-CoA racemaza (AMACR), ki je konsistentno bolj izražen v rakastih celicah prostate, kot v zdravih celicah.
Slika 13 – Z imunohistokemijsko reakcijo obarvana maligna žleza v prostati – pozitivna za AMACR
Zaključek
Proteomika je v zadnjih letih zelo napredovala in postala uporabna veja biokemije. Ker se lahko proteini pri boleznih spremenijo na različne načine, je proteomika primernejša od genomike, ki npr. ne more »zaznati« post-translacijsko modificiranih proteinov. V prihodnjih letih pričakujemo inovacije, ki bodo povišale občutljivost, zmanjšale količino potrebnega vzorca za analizo, povečale prepustnost in bolj enostavno in efektivno odkrile različne spremembe proteinov. V kratkem pričakujemo tudi vstop proteomike v klinične vede, kar bo izboljšalo diagnoziranje in olajšalo in pohitrilo razvoj specifičnih zdravil.
Literatura
[1] Hanash, S. Disease proteomics. V: Nature Vol. 422, 2003, str. 226-232
[2] Nelson, D. in Cox, M. Lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. New York: W.H. Freeman and Company, 2005.
7
[3] Donald, V. in Judith. V. Voet&Voet Biochemistry. 3rd ed. New York: Wiley, 2004.
[4] ExPASy Technical information on 2-D PAGE (online). (Švica): Swiss Instutite of Bioinformatics. (citirano 01.04.2005). Dostopno na naslovu: http://www.expasy.org/ch2d/protocols/
[5] Wikipedia Mass Spectrometry (online). Wikipedia. (citirano 01.04.2005). Dostopno na naslovu: http://en.wikipedia.org/wiki/Mass_spectrometer
[6] Lemkin, Peter F. 2D Gel Images - Flicker Compare from Leukemia Study (online). Laboratory of Experimental and Computational Biology. (citirano 01.04.2005). Dostopno na naslovu: http://www-lecb.ncifcrf.gov/flicker/leukFlkPair.html
[7] Willard-Gallo, K.; Humblet, Y. in Symann, M. Leukocyte membrane proteins in chronic lymphocytic leukemia, as studied by two-dimensional gel electrophoresis. V: Clinical Chemistry, Vol. 30, str. 2069-2077. Dostopno na: http://www.clinchem.org/cgi/content/abstract/30/12/2069
8