Identifikacija prionskih proteinov z metodo PMCA



Uvod
Napačno zvijanje proteinov je pri človeku krivo za veliko število obolenj, še posebej pa za veliko večino nevrodegenerativnih bolezni. Pred kratkim je bila predstavljena metoda, ki omogoča ojačanje napačnega zvijanja proteinov in vitro. Ta metoda je po zasnovi precej podobna povečevanju DNA s procesom PCR (polimerazna verižna reakcija). Metodo so avtorji poimenovali PMCA (protein misfolding cyclic (ampllification) amlification). PMCA ima zelo pomembno vlogo pri raziskovanju, diagnosticiranju in zdravljenju (boleznih) bolezni, nastalih zaradi napačnega zvijanja prionskih proteinov.

Prioni
Biološka aktivnost proteinov je odvisna predvsem od tega, kako se protein zvije v njegovi nativni konformaciji. V procesu zvijanja proteinov polipeptidne verige oblikujejo natančno določeno 3D strukturo, ki jo uravnavajo in kontrolirajo celični proteini kot so šaproni in proteaze. Skozi zadnjih nekaj let je postalo jasno, da je za veliko hudih obolenj pri človeku krivo napačno zvijanje drugače zdravih proteinov. Te bolezni so sedaj poimenovane PCD (protein conformational disorders). Med te bolezni spadajo ne le večina nevrodegenerativnih bolezni (Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen, amiotropična lateralna skleroza, Huntingsonova bolezen in pa TSE ( transmissible spongiform encephalopathy) pač pa tudi druge motnje v telesu kot so diabetes tipa 2, cistična fibroza, hemolitična anemija in še več kot 15 drugih manj znanih bolezni. Od vseh omenjenih bolezni so verjetno najbolj raziskane prionske bolezni, kar je drugo ime za TSE. Prionske bolezni so mnogokrat usodne, pojavijo pa se tako pri človeku kot tudi pri drugih sesalcih. Prionske bolezni so relativno redke, a so v zadnjem času zbudile kar precej pozornosti - tako med strokovnjaki, kakor tudi med javnostjo - zaradi variante Creutzfeldt-Jakobove bolezni, ki so jo povezovali z uživanjem mesa okuženega z BSE (bovine spongiform encephalopathy) znano kot bolezen norih krav. TSE so edine izmed PCD, ki so infekcijsko prenosljive. Med strokovnjaki je prišlo do veliko različnih mnenj in diskusij glede na način prenosa in širjenja bolezni. Prevladuje pa mnenje, da je najpogostejši vzrok za spremembe celičnega prionskega protein PrPc v patogeno obliko PrPsc spontana sprememba celičnega prionskega proteina PrPc v patološko izoobliko. Kljub temu pa strokovnjaki mislijo, da gre v nekaterih primerih za spremembe v genih, za katere pa vzroki še niso znani. Značilnost PrPsc oblike pri TSE je konformacijska sprememba v molekuli PrPc, ki povzroči rezistenco proteina na delovanje encimov proteaz. Prav tako je ta protein (sposobnem) sposoben sam spreminjati oz. katalizirati spremembo molekule normalnega prionskega proteina v patogeno. Ta proces je posttranslacijski in domneva (sem) se, da pri tem sodelujejo dejavniki, ki se nahajajo v sami celici. Skozi ves ta proces pa lahko vsaka molekula PrPsc transformira tudi več milijonov molekul PrPc. Vseeno pa ta proces traja relativno dolgo časa, od nekaj mesecih pa do nekaj let. To je zelo variabilno in je odvisno od vrste živali. Primer: miš 2-4 mesece, krava 3-5 let, človek 7-40 let.


Metoda PMCA
Replikacija konformacije proteinov, ki vodi v spremembo le-teh in na sploh na spremembo fenotipa posameznika je revolucionaren koncept v biologiji. Nedolgo nazaj smo bili prepričani, da so le nukleinske kisline sposobne replikacije in prenosa bioloških informacij. Sposobnost samoreplikacije DNA je bila uporabljena pri metodi PCR, kjer in vitro povečamo števila delcev DNA. Pri PCR metodi imamo na razpolago zelo majhne količine DNA, ki nam služijo kot podlaga, ki jo s pomočjo metode PCR nekajkrat pomnožimo. Vprašanje, ki se je pri tem porajalo je bilo kako razviti analogen sistem, ki bi lahko služil povečevanju proteinov. To idejo pa nam omogočajo prionski proteini, ki imajo samoreplikacijsko sposobnost, pri tem pa ohranjajo svoje biološke lastnosti. PMCA nam omogoča, da minimalno količino PrPsc pomnožimo na tako količino, da jo lahko z drugimi metodami sploh zaznamo. Pri tem pa uporabimo velike količine PrPc. Čeprav natančen mehanizem prionskega repliciranja še ni popolnoma znan, pa je postalo očitno, da je vpletena bližnja interakcija med obema proteinskima izooblikama, pospešena preko do sedaj še neznanega šapronu-podobnega proteina. PrPsc je oligomer različnih velikosti, ki lahko tvori velike fibrilarne skupke, ki so podobni (amiloidnih) amiloidnim fibrilam pri Alzheimerjevi bolezni. Primerjava prionskih pretvorb s procesom amiloidoze, nam podaja model za pretvorbo PrPc v PrPsc, pri tem pa služi patološki protein kot zasnova, ki zbere delno napačno zvite PrPc in jih stabilizira tako, da jih vgradi v svoj oligomer, ki se zato zmeraj daljša, in sicer z vsakim dodanim PrPc. Kinetika take pretvorbe je omejena s številom oz. s količino PrPsc v vzorcu. Ta omejen proces delno razloži, zakaj je potrebno v živih bitjih toliko časa, da se ustvari dovolj velika koncentracija PrPsc, da se sproži nevrodegeneracijo.
V prvi fazi imamo vzorec, ki vsebuje minimalne količine PrPsc in velik presežek PrPc, pod ustreznimi pogoji pa to incudira rast PrPsc polimerov. V drugi fazi je vzorec dan pod ultrazvok, ki razbije polimere. S tem se poveča število spreminjajočih enot in sicer pride do eksponentne povečave.Ciklična uporaba proteinov dovoli uporabo tolikih ciklov, kolikor jih pač rabimo, da dobimo zaznavno količino PrPsc v določenem primeru.
PMCA zahteva substrat PrPsc, ki mora biti v visokem molarnem presežku v primerjavi z PrPc, da ta proces sploh lahko poteče. Metoda prav tako zahteva uporaba določenih celičnih faktorjev. Ker so ravno možgani tarčni organ TSE in tkivo, kjer poteče največ pretvorb, so v poskusih za vir PrPc uporabili vzorec iz zdravih možganov. Pogoji so bili izbrani tako, da bi čim bolj ustrezali fiziološkim (pH, ionska moč), da bi se tako izognili vplivu interakcij med različnimi komponentami. Prav tako je bila vzorcu dodana majhna koncentracija detergentov. (triton x-100, SDS (sodium dodecyl sulfat), da bi se preprečila netopnost proteinov in bi se zreducirale morebitne nespecifične interakcije.
PrPc v vzorcu ne pridobi proteazne rezistence (se ne spremeni v PrPsc) preko PMCA metode, če ni prisotnega PrPsc. Enako se tudi signal, ki ga daje PrPsc ne modificira v ciklu (inkubacija + obdelava z ultrazvokom), če ni prisotnega ustreznega substrata PrPc. Čeprav se postopek zdi zelo enostaven, je vendarle potrebno upoštevati veliko tehničnih podrobnosti. Na primer, shranjevanje in pogosto zmrzovanje in odtajanje možganov kot vzorec, saj le to lahko zmanjša učinkovitost vzorca. Podobno se dogaja, če raztopino vzorca centrifugiramo pri visokih obratih. Posebno pozornost pa je treba nameniti obdelavi vzorca z ultrazvokom ter še posebej časovnim razmahom med dvema obdelavama, saj mora biti ta razmah točno določen glede na to, kakšen vzorec imamo (od katere vrste je vzorec).
Glavna prioriteta PMCA metode je v tem, da lahko natančneje identificiramo živali in ljudi, ki nosijo TSE bolezen ter še naprej razvijamo načine, kako bolezen ustrezno terapevtsko zdraviti. PrPsc je edini potrjeni marker za TSE, dokončna diagnoza pa je možna le iz vzorca možganov okuženega osebka. Problem, ki pri tem nastane pa je, da se PrPsc pojavi v zadostni količini za zaznavanje šele takrat, ko se je bolezen že kar dobro razvila. Vseeno pa so prisotni tudi dokazi, da se prioni nahajajo v minimalnih količinah tudi v perifernih tkivih kot so npr. kri in limfatični organi. PMCA nam daje možnost, da iz neke nezaznavne minimalne količine PrPsc, ki je potencialno prisoten v vzorcu krvi ali čem podobnem, napravimo takšno količino, da jo lahko zaznamo in je tako omogočena zgodnja diagnoza za TSE. Cilj PMCA pa ni samo zaznavanje prionov v možganih v zgodnjih predsimptomatičnih primerih, pač pa tudi izdelava testa za žive osebke (ljudi in živali).
PMCA omogoča tudi vrednotenje infektivnih lastnosti PrPsc izdelanih in vitro, saj je - po ojačitvi v optimalnih pogojih - večina proteinov odpornih na proteaze, (več kot 99) sestavljenih s strani novo produciranih PrPsc. Velik donos po obratu je bistven v tem, da lahko razlikujemo na novo ustvarjeno družbo od tiste, ki je proces povzročila.
Do obrata iz celične oblike proteina v patološkega pa sploh ne pride, če v ta eksperiment zmešamo samo ta dva proteina, kar nam daje dokaz, da so potrebni tudi drugi faktorji v možganih, ki katalizirajo pretvorbo PrPc v PrPsc. Zaradi tega bi bila metoda PMCA lahko uporabna tudi za identifikacijo ravno teh, zaenkrat še neznanih možganskih faktorjev.


Povzetek
Nepravilno zvijanje proteinov je krivo za veliko težkih obolenj, znanih kot PCD. Take bolezni so Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen, TSE,…Od teh bolezni so najbolj raziskane TSE, imenovane tudi prionske bolezni, ki so postale aktualne predvsem zaradi bolezni norih krav. Čeprav se ne ve točno, kako se te bolezni prenašajo prevladuje mnenje, da je vzrok v spontani spremembi celičnega prionskega proteina PrPc v patogeno izoobliko PrPsc. Značilnost PrPsc oblike pri TSE je konformacijska sprememba v molekuli PrPc, ki povzroči rezistenco proteina na delovanje encimov proteaz. Ta proces pa lahko traja tudi po več let. Metoda PMCA je konceptno analogna PCR pri DNA, izkorišča pa samoreplikacijsko sposobnost, a kljub temu ohranja svoje biološke lastnosti. PMCA nam omogoča, da minimalno količino PrPsc pomnožimo na tako količino, da jo lahko z drugimi metodami (lahko) zaznamo. Čeprav natančen mehanizem prionskega repliciranja ni popolnoma znan, pa je očitno, da je vpletena bližnja interakcija med obema proteinskima izooblikama, pospešena preko šapronu-podobnega proteina. PMCA je sestavljena iz ciklov pospešenih prionskih reakcij, vsak cikel pa je sestavljen iz dveh faz: inkubacije in obdelave z ultrazvokom. PMCA zahteva substrat PrPsc, ki je v molarnem presežku v primerjavi z PrPc, da ta proces sploh lahko poteče. Metoda prav tako zahteva uporaba določenih celičnih faktorjev. Glavna prioriteta PMCA metode je v tem, da lahko natančneje identificiramo živali in ljudi, ki nosijo TSE bolezen ter še naprej razvijamo načine, kako bolezen ustrezno terapevtsko zdraviti.