Ločevanje proteinov in dokazovanje njihove prisotnosti


Dvodimenzionalna gelska elektroforeza je metoda za ločevanje proteinov in je sestavljena iz dveh postopkov.

IEF ali isoelectric focusing (izoelektrično fokusiranje)je postopek, ki loči proteine glede na njihov naboj oz. njihovo izoelektrično točko (pH, pri katerem je molekula v električnem polju negibna, nevtralna).
Električno polje ustvarimo z anodo na enem in katodo na drugem koncu ravnine prekrite z medijem (gelom), po katerem se bodo molekule lahko gibale. Na ravnini pa je potem potrebno ustvariti še pH gradient, in sicer mora biti medij na sredini med obema elektrodama nevtralen, bolj proti anodi/katodi pa vse bolj kisel/bazičen.
Tak gradient ustvarimo z amfoliti (manjši proteinski oligomeri z amino- in karboksilnimi skupinami), ki v našem električnem polju vsi potujejo do njihovih izoelektričnih točk, saj naprimer tiste z več aminoskupinami (sprejmejo protone, pozitiven naboj) vleče h katodi bolj ali manj, odvisno od števila aminoskupin na molekuli. Njihovemu gibanju vseskozi nasprotuje poliakrilamidni gel, po katerem oligomeri potujejo, hkrati pa deluje kot mreža in na mestu zaustavi molekule, na katere deluje premajhna privlačna sila. Velikokrat gelu dodajo tudi ureo, ki se na molekule veže in povzroči denaturacijo proteinov, tako da zaradi spremenjene konformacije težje potujejo skozi poliakrilamidno mrežo.
Če sedaj v to električno polje dodamo zmes proteinov, tisti bolj negativni potujejo proti pozitivni anodi skozi vse bolj kisel medij in zato sproti sprejemajo protone, kar slej ko prej privede do njihove nevtralnosti. Tako se proteini ustavijo v svojih izoelektričnih točkah. Če slučajno katera molekula difundira nazaj v manj kisel predel, zopet dobi dovolj negativnega naboja, da jo privlačna sila vrne na svoje mesto.
Tako dobimo več pasov proteinov, katerih skupna značilnost je določena pI.




SDS-PAGE pa je postopek, s pomočjo katerega ločimo proteine glede na njihovo maso.
SDS (sodium dodecyl sulfate- slika zgoraj) je detergent, ki se podobno kot urea veže na proteine s hidrofobnimi interakcijami in spremeni njihovo konformacijo, vendar pa je SDS za razliko od uree negativno nabit. Ugotovili so, da se na en gram večine proteinov veže 1.4g SDS, to je približno ena molekula detergenta na vsaka dva aminokislinska ostanka, kar pomeni, da se na večje proteine veže več negativno nabitega SDS. Tako so bolj negativno nabite večje molekule in nanje zato delujejo tudi večje privlačne sile. Problem bi lahko predstavljale različne oblike proteinov, ki bi lahko večjim proteinom otežile gibanje skozi gel, vendar pa SDS kot detergent spremeni konformacije vseh proteinov v trakovom podobne oblike. Pozabili smo tudi na lastni naboj proteinov, zaradi katerega bi se bolj pozitivni proteini gibali počasneje navkljub večji masi, vendar pa naboj, ki ga prinese SDS, prekrije ostale nabite delce.


Če tako recimo na ravnini v horizontalni smeri naredimo IEF in v vertikalni še SDS-PAGE (slika levo) lahko ločimo tudi do 5000 različnih proteinov. Dvodimenzionalna elektroforeza tako predstavlja zelo učinkovito metodo za proteomiko, ki se ukvarja z raziskovanjem proteoma (skupek vseh proteinov določenega organizma).





CE (capillary electrophoresis) ali kapilarna elektroforeza (slika spodaj) je veliko hitrejša od gelske, ki lahko traja tudi več ur in jo je zelo težko avtomatizirati.
Pomembno je, da pri tej metodi lahko uporabljamo močnejša električna polja, ne da bi bistveno vplivali na temperaturo v kapilari, kar bi lahko povzročilo denaturacijo proteinov.
Zelo tanke kapilare (od 20 do 100 μm premera), narejene iz plastike, kristalov ali stekla, pa se zelo hitro hladijo in omogočajo uporabo močnejših, tudi do 10 krat večjih, električnih polj, ki ves postopek skrajšajo na nekaj minut.
Seveda pa tako tanke kapilare ne dovoljujejo ločevanje le majhnih vzorcev, poleg tega pa potekajo le v eni ravnini, kar pomeni, da lahko uporabimo le IFE ali SDS-PAGE, ne pa kombinacijo obeh.









DNA čipi pa se uporabljajo za dokazovanje prisotnosti proteinov, katerih zgradbo že poznamo.
Čipi so pravzaprav kvadrataste mreže širine 1 cm, prekrite z najlonom ali steklom v katerega so , na presečiščih premic, ki mrežo sestavljajo,vsidrane molekule oligonukleotidov.
Najprej je seveda potrebno tak čip izdelati po fotolitografski metodi. Na površini čipa so oligonukleotidi že vezani na steklo oz. najlon, vendar pa ti služijo le kot vez med podlago in zaporedjem nukleotidov, ki ga je še potrebno dodati. To storimo tako, da na 5` konce oligonukleotidov vežemo fotokemično odstranljive zaščitne skupine in čip prekrijemo z masko, ki ščiti te skupine pred svetlobo. Vendar pa v maski obstajajo luknjice, skozi katere svetloba lahko prodre in odstrani zaščitne skupine, ter tako omogoči, da na željene oligosaharide vežemo poljuben nukleotid (slika spodaj). Ta postopek ponovimo tolikokrat, da dobimo zaporedja nukleotidov, ki so enaka zaporedjem v določenih genih.

Ti čipi nam lahko pomaga pri ugodavljanju prisotnosti določenih proteinov v organizmu, saj lahko iz organizma izločimo, mRNA, na njej iz obarvanih (fluorescentno označenih) nukleotidov izgradimo cDNA (komplementarna). Vodno raztopino cDNA potem kapnemo na površino čipa, kjer se spoji z zaporedji, ki ji najbolj ugajajo, tiste cDNA, ki pa se ne vežejo pa speremo z vodo.
Tu se pojavi problem, saj se cDNA veže tudi na zaporedja, ki niso popolnoma komplementarna, vendar pa pod laserjem veliko močneje fluorescirajo tista mesta na mreži, kjer se cDNA veže popolnoma (animacija na www.bio.davidson.edu/courses/genomics/chip/chip.html).












Uporaba metod elektroforeze za odkrivanje bolezni

Kljub boljšemu poznavanju molekularnih osnov bolezni kot je rak, pa je samo razumevanje nastanka teh bolezenskih stanj in metode, ki bi omogočale čim hitrejšo diagnozo teh stanj še vedno precej neraziskano.Trenutno se pojavlja veliko zanimanje za proteomiko, katere najbolj obetaven del zavzema raziskovanje izražanja proteinov na tkivni, celični in subcelični ravni ter proteinskih kompleksih in bioloških tekočinah in obsega tudi razvoj novih biomarkerjev za diagnozo in preddiagnozo. Največji obeti pa seveda ležijo v novih terapevtskih metodah in hitrejšemu razvoju zdravil.
Kljub dobrim obetom pa obstajajo razne tehnološke težave, saj če je bilo razvozlanje človeškega genoma težavno, obstajajo tukaj še dodatni vidiki, in sicer kako se določeni proteini izražajo, kako sodelujejo z drugimi proteini in kako se to izraža na organizmu.

Uporaba dvodimenzionalnih gelov

Danes najbolj uporabljana metoda za ugotavljanje izražanja proteinov je uporaba dvodimenzionalne poliakrilamidne gelske elektroforeze (2D PAGE) kombinirane z masno spektrometrijo.
Veliko študij na začetku je temeljilo na ustvaranju koktejla vseh proteinov v celični populaciji, tkivu ali biološki tekočini, kateremu je sledila separacija proteinov s pomočjo 2D gelov in barvanja s srebrom. Slabost te metode tiči v tem da je s tem lahko bilo prikazano le omejeno število proteinov. Vendar kljub pomankljivostim so lahko prikazali različne podtipe levkemije. Pri študiji srčnih bolezni so ugotovili veliko število patoloških stanj, katere so se odločili kartirati in tako ustvariti bazo podatkov za primerjavo. Z primerjavo pri ljudeh in živalih so ugotovili različne spremembe v zgradbi proteoma, ki so vplivale na proteine z različnimi funkcijami. Tako so poročali o splošni spremembi določenih proteinov ali pa o post-translacijskih spremembah proteinov na primer miozinske verige v zastoječem srcu.
Pomemben korak v metodi je bil začetek uporabljanja stalnega pH gradienta (IPG) v akrilamidnem matriksu, ki omogoča uporabo natančno definiranega pH območja. Takim gelom se reče tako imenovani ˝zoom˝ geli, v katerih so proteini najprej frakcionirani v ozkem pH območju pod nizko ločljivostjo, kateri potem sledi visokoločljivostna separacija z 2D PAGE vsakega posameznega območja. Kot primer; z prefrakcionacijo seruma so izboljšali zmožnost detekcije majhnih proteinskih ostankov in potencialnih novih bolezenskih proteinov. Drug primer inovacije je pa uvedba diferencialne znotraj gelske elektroforeze (DIGE) v kateri sta dva vzorca različno flouroscentno obarvana. Označeni proteini so nato zmešani skupaj in ločeni v istem 2D gelu. V eni izmed študij so s to metodo uspeli diferencirati razlike v odražanju proteinov epitelnih rakastih celic požiralnika in zdravih epitelnih celicah požiralnika. Odkrili so da je bilo veliko število proteinov povečano ali zmanjšano v rakastih celicah.

Največji problem 2D gelov tiči v dejstvu, da je potrebno dosti snovi za analizo, kar pa je velik minus ker ne moremo vzeti večje količine tkiva iz telesa. Zato ni tako uporabna metoda za klinično uporabo, čeprav je metoda poceni in je trenutno najbolj raziskana. Problem tiči tudi v heterogenosti tkiv, kar pa se da delno razrešiti z bolj finim rezanjem, vendar s tem spet izgubimo velik del tkiva. Zaradi tega bodo imele metode, ki bodo temeljile na tekočinski separaciji veliko prednost v prihodnosti, predvsem zaradi velike možnosti avtomatizacije. Pomembne so tudi metode, ki ne temeljijo na separaciji, kot so proteinske mikromreže in masna spektrometrija.
Masna spektrometrija se je začela uporabljati pri in situ proteomičnih analizah tkiv, metodi ki temelji na prikazovanju proteinov v zdravih in bolnih tkivih.



Uporaba proteinskih mikromrež

DNK mikromreže so ogromno prispevale k razpoznavanju izražanja RNK in s tem povezan vpliv na bolezenska stanja.Vendar pa so raziskave pokazale da obstaja zelo majhna povezava med izražanjem RNK in dejanskim stanjem, zato se je začela pobuda za razvoj biočipov, ki omogočajo sistematsko analizo ogromnega števila proteinov.
Z razliko od DNK mikromrež, ki nam dajejo samo eno obliko izražanja gena, se je pojavila težnja po implementaciji proteinskih mikromrež, ki se nanašajo na veliko število različnih lastnosti proteinov, ki se lahko spremenijo pri bolezni. Težnje po uporabi proteinskih čipov so pripeljale razna biotehnološka podjetja v razvoj biočipov za medicinske raziskave.
Z začetkom študij, ki uporabljajo proteinske mikromreže so že nastali tudi modeli za boljše razumevanje vzorcev kako proteini vplivajo na mikrookolje tkiv.
Klinično relevantna uporaba proteinskih mikromrež je v identifikaciji proteinov, ki inducirajo imunski(protitelesni) odgovor v avtoimunih motnjah. Mikromreže so bile narejene z vezavo nekaj sto proteinov in peptidov na obdelane steklene plošče. Mreže so bile inkubirane z serumom pacienta, in flouroscentne oznake so bile uporabljene za detekcijo vezave protiteles na specifične proteine v avtoimunskih boleznih, z sistemskim lupusem erythematusem in revmatičnim artritisom.

Iskanje bolezenskih biomarkerjev s pomočjo proteomike

Velik interes se pojavlja v uporabi proteomike za identifikacijo bolezenskih markerjev. Pristopi vsebujejo primerjalno analizo izražanja proteinov v zdravih in bolnih tkivih za identifikacijo odstopajočih izražanj proteinov, ki bi lahko predstavljali nove biomarkerje , analizo izločenih proteinov v celičnih linijah in primarnih kulturah, in direktno serumsko profiliranje proteinov. Potencial metode masne spektroskopije da zagotavlja konkreten profil peptidov in proteinov v bioloških tekočinah brez predhodne separacije, je pritegnila ogromno pozornosti zaradi primernosti za identifikacijo markerjev, saj potrebuje manj vzorca za analizo in zagotavlja dobre rezultate.


Prispevek proteomike k raziskavi zdravil

V zadnjem času se je pojavilo tudi številno zanimanje za implementacijo proteomike v razvoj zdravil, saj večina zdravil deluje ravno na proteine.Vendar so zaradi pomanjkanja tehnologij za raziskavo proteinov, podjetja precej skeptična in se bolj obračajo k genomskim programom, če pa bo na voljo primerna tehnologija, pa se sigurno obeta aktivna implementacija proteomike v razvoj zdravil, predvsem pri ugotavljanju reakcije zdravil, ki jih sprožijo in s tem bi nam bilo omogočeno proizvajati zdravila brez stranskih učinkov.



Figure 4 Chromophore-assisted laser inactivation. This technology involves the generation of short-lived radicals that induce covalent modifications at spatially restricted sites on a protein49. A transient functional inactivation occurs if the radicals modify amino acids of the target protein that have a functional role. A target protein (a) is complexed with a ligand (yellow; for example, antibody, antibody fragments such as scFv and Fab, peptide, nucleic acid aptamers or small molecules) labelled with dye molecules (green; for example, malachite green or fluorescein) (b). The complex is irradiated with laser or incoherent light (red lightning), leading to the generation of reactive species (concentric circles) that travel a short distance (c). The reactive species in turn lead to modifications (black) of nearby amino acids (d). If the modified amino acids are responsible for a function, that particular functional protein domain will be inactivated, leaving the other functional domains intact.


POVZETEK

-2D gelska elektroforeza je sestavljena iz dveh postopkov: izoelektričnega fokusiranja(razvrščanje proteinov glede na izoelektrično točko) in SDS PAGE gelske elektroforeze
-kapilarna elektroforeza omogoča hitrejše ločevanje s pomočjo električnega polja
-DNA čipi se uporabljajo za dokazovanje prisotnosti že znanih proteinov
-uporaba 2D gelske elektroforeze za profiliranje proteinov s pomočjo masne spektrometrije predstavlja splošno najbolj uporabno in raziskano metodo za proteinske raziskave
-proteinske mikromreže ki so analogna tehnologija DNA mikromrežam in prinaša dobre obete za prihodnost v odkrivanju in označevanju proteinov
-uporaba biomarkerjev je zelo efektivna metoda, saj potrebuje manj vzorca
-uporaba proteomike v farmaciji je zaenkrat še nerealistična, ker še področje ni dovolj raziskano.