1. Klinični primer

• 35 let staro, prej zdravo žensko, najdejo v stanju zožene zavesti. Dihanje je plitko in upočasnjeno, dobro vidna je cianoza. Opazne so fascikulacije. Zaradi prejšnje samomorilske naravnanosti pomislijo na samozastrupitev.
• Bolnica je bila sprejeta v bolnišnico, kjer je postala apnoična in hipotenzivna. Pulz je bil upočasnjen, zenici sta bili zoženi. Plinska analiza arterijske krvi je pokazala hudo kombinirano metabolno in respiratorno acidozo (pH=6.25, pO2=54mmHg, pCO2= 78mmHg)
• Sprali so želodec in uporabili aktivno oglje in laksativ. Uvedli so mehanično ventilacijo. Pričeli so z dajanjem atropina in obidoksima.



2. Načini zastrupitve


Kemijsko so organofosfati estri fosforne kisline in njenih derivatov. Po biološkem delovanju so inhibitorji acetilholinesteraze; inhibicija tega encima je skupni imenovalec vseh znakov zastrupitve. Najpogostejši načini zastrupitev so:

• V kmetijstvu - uporaba organofosfatnih pesticidov ob neustrezni zaščiti
Sem lahko prištejemo tudi zastrupitve otrok, ki pridejo v stik s pesticidi kadar ti niso varno spravljeni

• Pri poskusih samomora

• Potencialno: kemijsko so organofosfati tudi živčni bojni strupi

Od načina zastrupitve je odvisno po kakšni poti bodo organofosfati vstopili v organizem.

Organofosfati lahko vstopijo v telo z absorpcijo preko kože- nekaj tudi preko očesne veznice, z vdihavanjem aerosola preko sluznice dihal, lahko pa tudi preko sluznice prebavil pri zaužitju. Znaki zastrupitve se pojavijo že v nekaj minutah, zato je potrebno klinične znake hitro prepoznati in ustrezno ukrepati.

3. Znaki zastrupitve z organofosfati

Znake zastrupitve delimo na primarne in sekundarne.

3.1. PRIMARNI ZNAKI

Med primarne znake uvrščamo tiste, ki se pojavijo zaradi neposrednega delovanja organofosfatov, torej zaradi inhibicije AChE. Opraviti imamo torej z učinki povečane koncentracije ACh v holinergičnih sinapsah, med katere sodijo:.

1. Živčno-mišični stik (motorična ploščica)
2. Avtonomno živčevje
SY
• gangliji
• stik preganglionarnih nevronov s celicami sredice nadledvičnice
• stik postganglionarnega nevrona z znojnico
PSY
• gangliji
• stik postganglionarnih nevronov z efektorskimi celicami
3. nekatere sinapse v centralnem živčevju

Povečana koncentracija ACh povzroči naslednje znake:

a) motorična ploščica (živčno-mišični stik)
• oslabelost mišic
• tetanične kontrakcije (preidejo v paralizo)

b) avtonomno živčevje
psy:
• bradikardija
• hipotenzija
• zožene zenice (mioza)
• močno solzenje, slinjenje
• zmanjšana ventilacija alveolov hipoksemija
• kolike, nehotena defekacija
• nehotena mikcija
• slabši vid
sy:
• bledica
• znojenje

c) CŽS:
• fascikulacije (spontane kontrakcije posameznih motoričnih enot)
• motnje zavesti
• konvulzije
• centralno povzročena hipoventilacija
• centralno povzročena hipotenzija
• hipotermija


3.2. SEKUNDARNI ZNAKI

Sekundarni znaki nastanejo kot posledica primarnih. Med te uvrščamo:
• centralna cianoza
• periferna cianoza
• respiratorna acidoza
• metabolna acidoza



4. Mehanizem nastanka znakov zastrupitve

Vzrok vseh zgoraj naštetih znakov in simptomov je kopičenje ACh v holinergičnih sinapsah, ki ga izzovejo organofosfati z inhibicijo acetilholinesteraze (AChE) - encima, ki razgrajuje Ach.

4.1. Holinergični receptorji

Nahajajo se na specifičnih mestih postsinaptične membrane holinergičnih sinaps.
Delimo jih na nikotinske (nAChR) in muskarinske (mAChR).

a) Nikotinski receptorji (nAChR)

Nahajajo se v holinergičnih sinapsah:
• avtonomnih ganglijev
• motorične ploščice
• sredice nadledvičnice
• ponekod v CŽS

Nikotinski receptorji so hitro delujoči kemijsko odvisni ionski kanalčki. Sestavljeni so iz petih podenot in dveh receptorskih mest za ACh z visoko afiniteto + eno receptorsko mesto z nizko afiniteto. Prvo ima visoko afiniteto za ACh in je tako zasedeno že ob nižjih koncentracijah. Ob vezavi ACh se ionski kanalčki odprejo in tako postanejo prepustni za katione (Na+, K+). Pride do EPSP-ov, katerih amplituda je odvisna od koncentracije ACh. Ker je ta pri zastrupitvah z organofosfati visoka, pride do začasnih tetaničnih kontrakcij (Faza 1). Nadaljnje povečevanje koncentracije ACh povzroči zasedenje drugega vezavnega mesta, ki ima manjšo afiniteto za ACh, to pa povzroči desenzitizacijo in torej neodzivnost AChR za ACh, ki tako ne more več odpirati ionske kanalčke. Desenzitizacija se pri motorični ploščici odraža kot paraliza skeletne mišice (Faza 2).


b) Muskarinski receptorji (mAChR)

Nahajajo se v holinergičnih sinapsah:
• efektorskih organov, ki jih oživčujejo postganglionarna parasimpatična vlakna (srce, GIT, eksokrine žleze, m.cilliaris, m.sphincter pupilae...)
• ponekod v CŽS


Muskarinski receptorji so integralni membranski proteini, ki delujejo preko G proteina (aktivacija, inhibicija različnih intracelularnih efektorjev). Na različne organe delujejo ekscitatorno ali inhibitorno. So počasnejši od nikotinskih receptorjev, njihov specifični blokator pa je atropin.



4.2. Holinesteraze

Glede na reakcije s fosfatnimi estri ločimo tri tipe esteraz:

• A esteraze (npr. cyt P450) - hidrolizirajo nekatere organofosfate (naravna zaščita), nahajajo se v plazmi, ER hepatocitov, ...

• B esteraze (npr. AChE) - organofosfati jih inhibirajo.

• C esteraze – z organofosfati ne reagirajo



4.3. Mehanizem primarnih znakov in simptomov

• Parasimpatični sistem

Pri zastrupitvah z organofosfati pride do kopičenja acetilholina v sinapsah postganglionarnih nevronov z efektorskimi celicami. To povzroči enake učinke kot povečan parasimpatikotonus-poveča se odgovor efektorskih organov.


MESTO DELOVANJA UČINEK ZNAK ali SIMPTOM
OKO stimulacija m. sphincter pupillae mioza
stimulacija m. ciliaris-akomodacija za gledanje na blizu slabši vid
PREBAVILA povečana motiliteta prebavnega trakta (zaradi delovanja zvečane konc. ACh na ganglijske celice Auerbachovega plexusa in gladke mišice) diareja, nehotena defekacija, trebušni krči
SRCE povečan vpliv vagusa: zmanjšana frekvenca proženja SA vozla, daljši čas prevajanja impulzov; zaradi povečane prepustnosti za K+  hiperpolarizacija  zmanjšana odzivnost bradikardija  zmanjšan minutni volumen srca hipotenzija
DIHALA kontrakcija gladkih mišic bronhiolov, bronhosekrecija Zmanjšana ventilacija alveolov  hipoksemija
ŽLEZE povečano izločanje solznih žlez solzenje
povečana stimulacija slinavk slinjenje



• Simpatični sistem

Tudi tu pride do kopičenja acetilholina v sinapsah, kar se kaže kot povečan simpatikotonus.

MESTO DELOVANJA UČINEK ZNAK ali SIMPTOM
ZNOJNICE povečana stimulacija znojenje
SREDICA NADLEDVIČNE ŽLEZE Povečano izločanje adrenalinavazokonstrikcija, večja frekvenca proženja SA vozla, večja hitrost prenosa impulzov bledica, tahikardija

Učinki povečanega izločanja adrenalina zaradi organofosfatov so navadno slabo izraženi. Pogosteje se pojavijo pri manj prizadetih zastrupljencih, predvsem kot odraz povečanega simpatikotonusa zaradi stresa.

Učinek organofosfatov na simpatične in parasimpatične ganglije je sorazmerno majhen. To si razlagajo s slabim prodiranjem organofosfatov v te strukture zaradi ovojnic okrog ganglijev, ki to prehajanje močno otežujejo.

• Motorična ploščica

Zaradi zastrupitve z organofosfati se acetilholin kopiči tudi v živčnomišičnih stikih.
Posledice smo že opisali pri opisu nikotinskih receptorjev.

• Centralni živčni sistem

Ker so sinapse v CŽS slabše dostopne za eksperimentiranje kot živčno-mišični stiki, so tudi mehanizmi znakov zastrupitve z organofosfati v CŽS slabše raziskani, čeravno do njih pride. Med te znake štejemo: hipotenzijo, hipoventilacijo, hipotermijo, ki nastanejo zaradi učinkov zvečane koncentracije ACh v vasomotornem, dihalnem in termoregulacijskem centru.


4.4. Sekundarni znaki in simptomi

SEKUNDARNI ZNAKI IN SIMPTOMI VZROK NASTANKA
centralna cianoza hipoventilacija (zaradi paralize dihalnih mišic, bronhokonstrikcije, povečane bronhosekrecije, inhibicije respiratornega centra)
periferna cianoza bradikardija
respiratorna acidoza hipoventilacija
metabolna acidoza slabša oksigenacija tkiv nastaja laktat



4.5. Inhibicija acetilholinesteraze z organofosfati

Acetilholinesteraza (AChE)

AChE je serinska esteraza, ki katalizira hidrolizo ACh. Katalitski del sestavljajo tetrameri katalitskih podenot, vsaka podenota pa ima en aktivni center. Katalitski del je z disulfidnimi mostički povezan na kolagenski rep (strukturna podenota), s katerim je AChE pritrjena na bazalno lamino sinaptične špranje (ta način vezave je bil dokazan le za AChE na motorični ploščici).

V plazmi, na eritrocitih in v CŽS obstajajo druge oblike AChE. Vloga AChE na mestih, kjer ni ostalih komponent holinergičnega sistema ni znana, še posebej ker inhibicija te AChE ne povzroči nobenih kliničnih znakov. Vendar pa v primeru zastrupitve tudi te molekule AChE vežejo del organofosfatov in tako zmanjšajo njihovo koncentracijo in s tem raven inhibicije vitalno pomembne AChE. Zaradi tega ima »neholinergična« AChE v primeru zastrupitve zaščitno vlogo (vloga scavengerja – »pometača«)

Struktura organofosfatov:

Kemijsko so organofosfati estri fosforne kisline in njenih derivatov. V večini primerov za njih velja splošna formula:



X ali zapuščajoča skupina (»leaving group«) je radikal, ki v reakciji nukleofilne substitucije med organofosfatom in AChE zapusti kompleks kot anion. To je v reakcijah nukleofilne substitucije vedno radikal, ki je kot anion najstabilnejši in v spojini predstavlja najbolj elektronegativno substanco (npr. F je na tem mestu pogosto v organofosfatih, ki se uporabljajo kot bojni strupi). Ker je fluorid dobro obstojen kot anion, predstavlja zelo dobro zapuščajočo skupino, zaradi česar so nukleofilne substitucije med njim in serinsko OH skupino v aktivnem centru AChE zelo hitre. To seveda pomeni, da so doze, ki so potrebne za zastrupitve nižje oziroma, da so ob enakih dozah zastrupitve s temi organofosfati, v primerjavi z drugimi, težje.

B, B ali bazična skupina je lahko alkil, amin, alkohol ali amidna skupina.. Določa stabilnost celotne spojine, polarnost vezi P-X in lipidotopnost organofosfata. Daljši kot sta na primer alkilni verigi, bolj je organofosfat lipidotopen in lažje prehaja preko celične membrane in hematoencefalne bariere.

Pri nekaterih organofosfatih so aktivni šele njihovi metaboliti. Aktivacija lahko poteče z oksidacijo, izomerizacijo ali drugače.



Reakcija organofosfatov z acetilholinesterazo poteka v treh stopnjah:

1. Nastanek adsorbcijskega kompleksa
2. Nukleofilna substitucija
3. Hidroliza fosforilirane AChE


Slika 1: Reakcija acetilholina z aktivnim centrom AChE:




Slika 2: Reakcija organofosfata z aktivnim centrom AchE:





Reakciji AChE z njenim naravnim substratom oz. z organofosfatom se bistveno razlikujeta v tretji stopnji, torej v hidrolizi in sicer je hidroliza acetiliranega encima (ki nastane v reakciji z ACh) veliko hitrejša kakor pa hidroliza fosforiliranega encima, ki nastane v reakciji z organofosfati. Slednja poteka tako počasi, da govorimo o psevdoireverzibilni inhibiciji.
AChE s fosforiliranim serinskim preostankom v aktivnem mestu ne more hidrolizirati svojega normalnega substrata acetilholina in je tako inhibirana.


Detoksifikacija organofosfatov poteka v raznih organih, tudi v jetrih, kjer poteka hidroliza z A esterazami. A esteraze ne tvorijo stabilnih intermediatov z organofosfati. Produkti hidrolize se izločijo z urinom preko ledvic, manjši del organofosfatov, predvsem lipidotopnih, se izloči nespremenjen, posamezni pa se lahko celo nalagajo v organizmu in povzročajo ponovne zastrupitve.


5. DIAGNOSTIKA

Pri hudi akutni zastrupitvi je potrebno hitro ukrepati, zato diagnozo postavimo na podlagi kliničnih znakov zastrupitve, okoliščin v katerih najdemo bolnika in heteroanamneze. Diagnozo dokončno potrdimo z merjenjem aktivnosti eritrocitne in plazemske ChE. Aktivnost ChE pri zdravih ljudeh normalno variira, pri zastrupitvi pa bo vrednost aktivnosti ChE precej pod normalno vrednostjo (pod 50).

Pri postavljanju diagnoze upoštevamo vse informacije izpostavljene v razdelku simptomi in znaki. Bistvo je, da ne zanemarimo pomena ogleda zenic in anamneze.

Vsi znaki in simptomi niso vedno nujno izraženi. Nekateri izmed njih so lahko prikriti zaradi aktivacije simpatikusa, ki nastopi v zvezi s strahom pri zastrupljencu; npr. bradikardija je pri lažje zastrupljenih lahko slabo izražena ali pa preide v tahikardijo, predvsem na račun povečanega simpatikotonusa.

Pri diagnostiki zastrupitve z organofosfati si lahko pri odraslih pomagamo z akronimom SLUD (Salivation, Lacrimation, Urination, Defecation). Pri mlajših otrocih (starosti 3 leta in manj) pa je težko ločevati med nehoteno defekacijo in mikcijo, kot posledico zastrupitve, in normalno razvojno pogojeno inkontinenco, solzenje pa je lahko posledica joka zaradi strahu in bolečin.

Pri zaužitju organofosfatov je lahko pri zastrupljencu prisoten zadah po topilih, v katerih so organofosfati raztopljeni, zlasti kadar gre za sredstva, ki se uporabljajo v kmetijstvu. Zadah utegne spominjati na ketoacidozo in kadar imamo opravka z komatoznim zastrupljencem nas lahko ta podobnost zavede v napačno diagnozo (diabetična ketoacidoza in koma), še zlasti, če si nismo ogledali zastrupljenčevih zenic.


6. Zdravljenje

 Prva pomoč:

Najprej ločimo pacienta (zastrupljenca) od vira zastrupitve. Preverimo dihanje in bitje srca ter ravnamo v skladu s postopki nujne medicinske pomoči: zagotovimo proste dihalne poti; če je potrebno, izvajamo umetno dihanje in z masko dovajamo kisik; hkrati, ob morebitnem zastoju srca, izvajamo masažo srca.
Kontaminirano obleko odstranimo, kontaminirane dele telesa spiramo z vodo in milom ali z Na-bikarbonatom. Pri oralni zastrupitvi nezavestnemu izpiramo želodec, zavestnemu povzročimo bruhanje. Takoj za tem damo aktivno oglje, ki na sebe veže odvajala in strupene snovi, da se te ponovno ne resorbirajo v kri. Spremljajoče krče blažimo z Diazepamom ali z Na-tiopentalom (pri tem zdravilu je potrebno biti pazljiv, saj deluje na dihalni center).

 Simptomatsko zdravljenje:

Uporabljamo ATROPIN, ki deluje antagonistično na muskarinske receptorje, torej blaži znake povečanega parasimpatikotonusa: zmanjšuje prekomerno trahealnobronhialno sekrecijo in sekrecijo žlez slinavk, zviša frekvenco srca.
Atropin apliciramo v količinah zadostnih za prestop čez možgansko bariero – injiciramo ga intravenozno ali intramuskularno vsakih 5-10 minut, dokler ne izginejo muskarinski simptomi, oz. se že ne pokažejo znaki atropinizacije (1. dan potrebno cca. 200 mg).
Pozorni moramo biti, da ne povzročimo še zastrupitve z atropinom: velja, da se atropin daje do znakov atropinizacije, kot npr. suha usta, tahikardija, obstipacija, lahko tudi povišana telesna temperatura.
Atropin ne deluje na nikotinske receptorje (motorične ploščice) in zato nima vpliva na periferno nevromuskularno hiperaktivnost in paralizo, ki ji sledi.

 Etiološko zdravljenje:

Etiološko zdravljenje pomeni odstraniti vzrok zastrupitve. V tem primeru gre torej za odpravo inhibicije AChE. To lahko dosežemo z reaktivatorji AChE, ki so kemično razni OKSIMI. Gre za to, da na P atomu, kamor se je po nukleofilni substituciji z zapuščajočo skupino organofosfatov vezala OH skupina aktivnega centra AChE, (glej sliko 3) izvedemo ponovno nukleofilno substitucijo, kjer se bo OH skupina, ki bo zapustila P atom (reaktivacija AChE) nadomestila z oksimsko skupino. Terapijo vseskozi spremljamo z merjenjem aktivnosti AChE v serumu. Oksimfosfat, ki nastane ob regeneraciji, je v bistvu ponovno organofosfat; klinično so uporabni le oksimi, katerih oksimfosfati niso toksični.

Slika 3: Reakcija fosforiliranega encima z oksimom




Fosforilirana ChE začne hitro kazati nezmožnosti reaktivacije z oksimom oz. se »stara« in postane rezistentna na ChE reaktivatorje. Gre za odcep ene alkilne sk. na organoP delu, vezanem na ChE, kar spremeni obliko aktivnega centra in onemogoči reaktivacijo z oksimi.



















Literatura:

• Taylor P. Anticholinesterase agents. Goodman-Gilman: 161 – 176.
• Kort W.L.A.M., Kiestra S.H., Sangster B. The use of atropine and oximes in organophosphate intoxications: a modified approach. Clinical toxicology 1998; 26: 199 – 208.
• Zwiener R.J., Ginsburg C.M. Organophosphate and carbamate poisoning in infants and children. Pediatrics 1998; 81: 121 – 125.
• Guyton A.C., Hall J.E. Textbook of medical physiology. W.B. Saunders Company 1996.
• http://www.geocities.com/CapeCanaveral/Lab/7050/
• http://ffa-server.ffa.uni-lj.si/FK/Zasebni/Uni/TK/ZBstrupi.html
• http://www.bf.uni-lj.si/ag/fito/akt/2vsebina.htm