1. TEMELJNE ZNAČILNOSTI PLAZEMSKIH BELJAKOVIN

1.1 Normalne vrste in količina beljakovin v plazmi

Če preprečimo strjevanje krvi z dodatkom antikoagulanta (npr. heparin) in iz nje s centrifugiranjem izločimo krvne celice, dobimo krvno plazmo. Kadar pa pustimo, da se kri strdi, po centrifugiranju dobimo krvni serum, ki za razliko od plazme ne vsebuje fibrinogena. Klinično večino preiskav opravljamo v serumu.

Normalna koncentracija beljakovin v krvni plazmi je okrog 70 g/l.

Plazemske beljakovine s pomočjo elektroforeze krvnega seruma ločimo na pet frakcij: albumin, globulini 1 , globulini 2, globulini ß in globulini  . Z izjemo albumina so te frakcije mešanice različnih beljakovin.
Elektroforezo izvajamo na nosilcu- agaroznem gelu ali acetatni celulozi, po katerem potujejo proteini z različno hitrostjo odvisno od njihove velikosti, oblike in naboja. Potreben je alkalen medij, ki zagotovi negativen naboj proteinom. Tako proteini potujejo proti anodi. Proteini iste frakcije imajo podobne lastnosti, zato potujejo s podobno hitrostjo. Gel obarvamo in z merjenjem optične gostote izdelamo denzitogram. Iz razmerja med površino posameznega vrha in celotno površino denzitograma je razviden delež, ki ga predstavlja posamezna frakcija v primerjavi s celotno količino proteinov.
Slika 1: Elektroferogram in denzitogram krvnega seruma


1.2 Tvorba, značilnosti in funkcija plazemskih beljakovin

Albumin in proteini globulinskih frakcij  in  nastajajo v jetrih, globulini  (imunoglobulini) pa v plazmatkah, ki se diferencirajo iz limfocitov B.

Albumin
Albumin predstavlja 55-60 vseh plazemskih beljakovin. Ima relativno majhno molekulsko maso.
Funkcije: vzdrževanje onkotskega tlaka in transport različnih nizko molekularnih snovi (bilirubin, maščobne kisline, zdravila), služi tudi kot beljakovinska rezerva.
Sinteza albumina v jetrih je odvisna od onkotskega tlaka, pri znižanem onkotskem tlaku je pospešena, pri zvišanem zmanjšana.
Hitrost razgradnje eksponentno narašča z njegovo plazemsko koncentracijo (višja koncentracija pomeni nesorazmerno krajši razpolovni čas in obratno).
Zmanjšana količina albumina v plazmi povzroči povečan pritok albumina iz intersticija (tam se nahaja 60 vseh zalog albumina v telesu).

Sledijo najpomembnejši predstavniki globulinskih frakcij 1, 2, , .

Globulini 1
o 1-lipoprotein: največji delež 1-globulinov, transport lipidov;
o 1-antitripsin: inhibitor proteaz;
o kisli 1-glikoprotein: visoka vsebnost ogljikovih hidratov, fiziološka funkcija neznana.

Globulini 2
o haptoglobin: vezava hemoglobina, ki izstopa iz propadlih eritrocitov;
o ceruloplazmin: vezava bakra;
o 2-makroglobulin: inhibitor proteaz, vezava hormonov.

Globulini 
o -lipoprotein: transport lipidov;
o hemopeksin: glikoprotein, veže proste heme v molskem razmerju 1:2;
o transferin: vezava in transport železa;
o komponente sistema komplementa.

Globulini 
So imunoglobulini (protitelesa). Ločimo razrede IgA, IgD, IgE, IgG in IgM.

Zgradba IgG: sestavljeni so iz štirih peptidnih verig: dveh lahkih L-verig (vsako gradita po en konstantni in en variabilni del) in dveh težkih H-verig (trije konstantni in en variabilni del). Variabilni deli nosijo točno določeno sekvenco aminokislin, kamor se veže en antigen oziroma en njegov epitop. Konstantni deli protiteles lahko aktivirajo obrambo telesa, aktivirajo sistem komplementa.
Imunoglobulini nastajajo v plazmatkah – diferenciranih limfocitih B. Vsaka plazmatka lahko producira samo eno vrsto molekul Ig z določeno sekvenco v variabilnem delu.

Plazmatka ima na površini receptor, ki ima enako aminokislinsko sekvenco kot variabilni del protitelesa, ki ga tvori plazmatka. Vezava antigena (njegovega epitopa) na ta receptor sproži proliferacijo klona te plazmatke (klonska teorija), ki vse izločajo enako protitelo. En antigen ima več epitopov, zato se aktivira več klonov plazmatk – poliklonalni odziv.

Slika 2: Zgradba imunoglobulinov (IgG)




2. KVANTITATIVNE SPREMEMBE PLAZEMSKIH BELJAKOVIN

Koncentracija beljakovin v plazmi je določena z razmerjem med količino vseh proteinov in volumnom plazme.
Odstopanja od normalnih koncentracij vodijo v hiper- ali hipoproteinemijo, ki sta lahko absolutni (gre za spremembo količine proteinov) ali relativni (gre za spremembo volumna plazme).

• ABSOLUTNA HIPERPROTEINEMIJA
je vedno posledica povišanja koncentracij ene ali več patoloških komponent Ig sistema (najpogostejši vzrok je paraproteinemija).

•RELATIVNA HIPERPROTEINEMIJA
nastane zaradi zmanjšanja volumna plazme; poveča se tudi hematokrit (ob dehidraciji).

• ABSOLUTNA HIPOPROTEINEMIJA
se pojavi zaradi:
1. povečane izgube beljakovin, največkrat albumina, preko kože (opekline), ledvic (nefrotski sindrom) in črevesja (kronično vnetje: npr. Crohnova bolezen).
2. zmanjšane sinteze proteinov; vzrok so lahko okvare hepatocitov (bolezni jeter: ciroza, hepatitis), pomanjkanje aminokislin (bolezni prebavil: malabsorpcija, malnutricija – npr. pri beljakovinskem stradanju) ali spremenjena sinteza beljakovin pri citokinskem odzivu na stres.

• RELATIVNA HIPOPROTEINEMIJA
nastane, kadar pride do zadrževanja vode in elektrolitov v plazmi, bodisi zaradi popuščanja srca, odpovedi ledvic (anurije) ali pa zaradi prekomerne infuzije.


3. KVALITATIVNE SPREMEMBE PLAZEMSKIH BELJAKOVIN

Mednje uvrščamo disproteinemije, izpad posameznih beljakovin in paraproteinemije.

3.1. Disproteinemije
So stanja, pri katerih je spremenjeno običajno razmerje med deleži posameznih frakcij plazemskih beljakovin. Skupna vsebnost beljakovin v plazmi je še vedno v mejah normale na račun pospešene sinteze globulinov ob pomanjkanju albumina.

a) Akutna vnetna disproteinemija:
Pri poškodbah tkiv kot so miokardni infarkt, operacija, akutne infekcije in nekroza se sestava serumskih beljakovin tipično spremeni. V jetrih se poveča sinteza beljakovin akutne faze, predvsem globulinov  (haptoglobin, 1 - antitripsin, 1 - ceruloplazmin, C reaktivni protein), zmanjša pa se sinteza albumina in transferina. Celotna koncentracija beljakovin ostane enaka. Do teh sprememb pride predvsem zaradi citokinskega odziva na stres.

b) Kronično vnetna disproteinemija:
V poznejših fazah akutnega vnetja ali pri kroničnih vnetjih (kronične infekcije, alergijske in avtoimune bolezni, maligni tumorji) pride do sprememb na elektroforetski sliki serumskih beljakovin.
Zaradi povečane sinteze različnih imunoglobulinov, kar je odgovor na vdor antigenov, nastane poliklonska hiperimunoglobulinemija. Druge spremembe so nadaljevanje sprememb beljakovin akutne faze (frakciji globulinov 1 in 2 se povečata, frakcija albuminov se zmanjša).

c) Disproteinemija pri kroničnih obolenjih jeter:
Pri kroničnih jetrnih obolenjih (ciroza jeter, kronični hepatitis), najdemo visoke koncentracije imunoglobulinov. Večinoma so pomnožene tri glavne komponente sistema imunoglobulinov (IgG, IgA, IgM) zaradi vdora antigenov iz gastrointestinalnega trakta prek portokavalnih anastomoz v sistemsko cirkulacijo. Koncentraciji albuminov in beljakovin frakcije  sta zaradi propada hepatocitov znižani.

d) Izgube plazemskih beljakovin:
Skozi ledvice (nefrotski sindrom), GIT (enterična izguba beljakovin) in kožo (pri obsežnih opeklinah) se lahko izgubijo proteini v količinah, ki so nekajkrat večje od njihove fiziološke sinteze.

NEFROTSKI SINDROM:
Pri nefrotskem sindromu glomerulni filter ne zadržuje beljakovin. Na dan se tako z urinom izgubi 3,5 do 20 g plazemskih beljakovin (PROTEINURIJA). Njihov klirens se povečuje z manjšanjem njihove molekulske mase. Zmanjšanje količine albuminov v plazmi povzroči omejen porast sinteze albuminov in izrazit porast sinteze - globulinov, fibrinogena in lipoproteinov. Značilna serumska slika beljakovin kaže izrazito zmanjšanje količine serumskih albuminov ter močan porast globulinov 2 in .

3.2. Izpadi posameznih beljakovin

O izpadu posamezne beljakovine govorimo takrat, ko beljakovina ni prisotna oziroma je prisotna v spremenjeni obliki. Vzrok za to je ponavadi genetsko pogojen. Takšna stanja diagnosticiramo z imunoelektroforezo ali glede na izpad funkcije, ko je sprememba premajhna, da bi jo ugotovili z elektroforezo.

a) Pomanjkanje 1-antitripsina
Pri tej anomaliji je 1-antitripsin, ki je fiziološko pomemben inhibitor proteaz, zmanjšan na 10 običajne vrednosti. Deduje se avtosomno recesivno, pri čemer je tudi pri heterozigotih vsebnost antitripsina v serumu manjša kot običajno. Primarno je moten mehanizem izločanja in ne mehanizem biosinteze, zato je aktivnost proteaz v krvi in tkivih povečana. Posebej v pljučih pride do razcepov elastičnih vlaken, opazne so obstruktivne pljučne bolezni, še posebej juvenilni pljučni emfizem.

b) Pomanjkanje ceruloplazmina (Wilsonova bolezen)
Deduje se avtosomno recesivno in je ena najbolj pogostih dednih bolezni. Ceruloplazmin je najpomembnejši vezavni protein za baker v plazmi, zato njegov izpad povzroči hitro nalaganje bakra v tkivih (okvare zaradi prostih radikalov) in izločanje skozi ledvice. Ker je enterična reabsorpcija povečana, je bakrova bilanca pozitivna kljub povečanemu izločanju v urinu. V krvi pride do zmanjšane vsebnosti ceruloplazmina in bakra, v urinu in tkivih pa do dviga njune koncentracije. Pri odlaganju bakra v možganih nastopijo ekstrapiramidalni simptomi Parkinsonove bolezni, pri nalaganju v jetrih pa ciroza.


3.3. Paraproteinemije

Paraproteini (M-komponente, monoklonski imunoglobulini, nenormalni imunoglobulini) so sestavine sistema imunoglobulinov, ki ne nastanejo kot odziv na antigensko stimulacijo ampak ob avtoimuni proliferaciji plazmatk. Do tega pride zaradi odsotnosti kontrole nad razmnoževanjem plazmatk ali njihovih produktov. Struktura paraproteinov ustreza popolnim imunoglobulinom ali pa posameznim peptidnim verigam (L-verigam ali zelo redko H-verigam). L-verižni paraproteini se zaradi svoje majhne molekulske mase (22000, dimeri 44000) hitro izločajo skozi ledvice. V plazmi jih zato najdemo le pri odpovedi ledvic, v urinu pa redno (Bence-Jones proteinurija).
Identificiramo jih s pomočjo elektroforeze in denzitograma. Na denzitogramu je vidna sprememba frakcije globulinov γ. Na tem območju se pojavlja oster M vrh (M-spike).

a) Monoklonska imunoglobulinemija (gamapatija) nedoločenega pomena
Monoklonska imunoglobulinemija nedoločenega pomena pomeni navzočnost monoklonskih imunoglobulinov IgG, IgA, IgE, IgD v plazmi, vendar brez simptomov bolezni. Je posledica proliferacije klona plazmatk, ki pa je še delno kontrolirana.
Značilnosti so:
- koncentracija monoklonskih imunoglobulinov v plazmi je manjša od 30 g/l;
- delež plazmatk v kostnem mozgu je manjši od 10 ;
- vsebnost Bence – Jonesovih proteinov v urinu je manjša od 1g/dan;
- na rentgenskih posnetkih niso vidne osteolizne poškodbe kosti.
Pogostost bolezni s starostjo narašča, pogostejša je pri ljudeh starejših od 70 let. V približno petini primerov preide v maligno monoklonsko imunoglobulemijo.

b) Maligna monoklonska imunoglobulinemija
Multipli mielom (medularni plazmocitom)
Gre za maligno proliferacijo enega klona plazmatk v kostnem mozgu, ki poškodujejo skelet in tvorijo paraproteine razreda IgG, A, D ali E ali lahke verige paraproteinov. Značilnosti so:
1. osteoliza: preko citokinov tumorske celice aktivirajo osteoklaste. Pride do žarišč osteolize, kar vodi do hiperkalcemije in krhkosti kosti;
2. infekcije: paraproteini zavirajo sintezo fizioloških oblik IgG, hkrati pospešujejo njihovo razgradjo. Posledica tega je zmanjšana količina fizioloških IgG, ki lahko sodelujejo v imunskem odgovoru.
3. anemija: zaradi velikega števila plazmatk v kostnem mozgu je zavrta sinteza eritrocitov;
4. ledvična insuficienca: je posledica okvare ledvičnih tubulov. Do tega pride zaradi visoke koncentracije L-verižnih paraproteinov v lumnu, hiperkalcemije in nalaganja amiloida.
5. nagnjenost h krvavitvam: paraproteini se vežejo na faktorje strjevanja krvi in jih tako inaktivirajo.

Paraproteinemija IgM (makroglobulinemija Waldenström) se pojavlja zaradi povečanega izločanja IgM iz neoplastičnih plazmatk. Razvije se slika makroglobulinemije, ki se razlikuje od malignega mieloma po fizikalnih lastnosti velikih molekul IgM. Pri nekaterih bolnikih simptome neposredno povzroči paraprotein. Značilna je hiperviskoznost krvi, ki jo spremljajo sluznične krvavitve, retinopatija, izguba ostrine vida in nevrološke motnje. Lahko se pojavi tudi hemolitična anemija. Ni osteolize, povečane so vranica in bezgavke.

Posledice paraproteinov

1. Sindrom hiperviskoznosti
Visoka koncentracija beljakovin v serumu, najpogosteje makroglobulinov, lahko povzroči znatno povečanje viskoznosti krvi, kar včasih povzroči motnje krvnega obtoka v možganih, prstih, ledvicah ali očeh. Očesno ozadje ima karakterističen izgled zelo razširjenih venul s pogostimi krvavitvami. Razvijejo se tudi znaki popuščanja srca.

2. Krioglobulinemija
Podobna klinična slika lahko nastane zaradi prisotnosti krioglobulinov, beljakovin, ki kristalizirajo pri nizkih temperaturah, pri visokih pa se ponovno talijo. Včasih povzročijo Raynaudov fenomen (na hladnem postanejo prsti roke bledi, nato cianotični in rdeči, lahko celo gangrenozni). Večina klinično pomembnih krioglobulinov so Ig, delijo pa se na enostavne-monoklonske in mešane - poliklonske.
Monoklonski so običajno IgG ali IgM (multipli mielom, makroglobulinemija). Poliklonski pa so IgG-IgM (avtoimune bolezni vezivnega tkiva).

3. Bence – Jonesova proteinurija
Bence – Jonesovi proteini so κ in λ lahke verige (monomeri ali dimeri). Monomerne verige se filtrirajo v glomerulih, reabsorbirajo v proksimalnih tubulih, višek se izloči z urinom. Pri prehodu skozi distalne tubule in zbiralca se lahko tvorijo dimeri, ki poškodujejo tubule, kar vodi k odpovedi ledvic.
Bolezen se dokaže s testom koagulacije; pri segrevanju kislega urina na 40 do 60 °C se beljakovine obarjajo, vendar se ponovno raztapljajo, ko povišamo temperaturo na 90 °C. V zadnjem času jih dokazujemo z imunofiksacijo.


4. SEDIMENTACIJSKA HITROST ERITROCITOV

Hitrost eritrocitne sedimentacije je enostaven diagnostični laboratorijski test, ki so ga poznali že stari Grki. Hitrost sedimentacije rdečih krvničk je odvisna od aglutinacije eritrocitov in tvorbe stebričkov (rouleaux). Pri tem so pomembni plazemski proteini.
Eritrociti imajo na svoji površini negativen naboj (karboksilna skupina sialične kisline) in zaradi tega se med seboj odbijajo. In vitro sedimentirajo, ker je njihova gostota večja od gostote plazme. Slednja je viskozna tekočina, zato padanju eritrocitov nasprotuje sila upora, ki je odvisna od oblike delcev in je sorazmerna s hitrostjo padnja. Pri določeni hitrosti se sila upora izenači s silo težnosti in hitrost sedimentacije postane konstantna.
Ko se eritrociti zlepijo v stebričke, se razmerje med težo teh partiklov in njihovo površino poveča, upor se zato zmanjša in hitrost sedimentacije se poveča. Plazemske beljakovine s tem, ko se vežejo na eritrocite, povzročajo njihovo zlepljanje, ker nevtralizirajo negativni naboj na rdečih krvničkah. Težja in bolj asimetrična je molekula, manj se bodo negativni eritrociti odbijali med sabo. Največjo agregacijsko moč ima fibrinogen, sledijo globulini  in γ, najmanjši prispevek k sedimentaciji pa daje albumin. Zato na zvišano hitrost sedimentacije eritrocitov najbolj vplivajo beljakovine akutne faze nespecifičnega citokinskega odziva na stres.
Westergrenova metoda velja za standard v merjenju hitrosti sedimentacije eritrocitov. Krvi dodamo antikoagulant (natrijev citrat), jo posrkamo v cevko in pustimo stati eno uro v navpičnem položaju. Rezultat je razdalja od stebrička eritrocitov do vrha krvne plazme, ki ga izrazimo v milimetrih na uro.
Normalne vrednosti za ženske znašajo manj kot 25 mm/h, za moške pa manj kot 16 mm/h. Za starejše ljudi zgornjo mejo dobimo tako, da starosti ženske prištejemo 10 in delimo z 2, za moške pa leta starosti delimo z 2.

SEDIMENTACIJA ERITROCITOV V KLINIČNI PRAKSI
Rezultat hitrosti sedimentacije eritrocitov ponuja tri vrste informacij:
• kaže na prisotnost ali odsotnost bolezni,
• odraža napredovanje ali izboljšanje že prepoznane bolezni,
• omogoča izmeriti odziv na terapijo.

1. Znižana hitrost sedimentacije
Pojavi se lahko kot posledica sprememb v eritrocitih ali pa zaradi abnormalnosti v plazemskih proteinih, vendar nima nobenega diagnostičnega pomena.

2. Zvišana hitrost sedimentacije
Na povišanje hitrosti lahko vpliva več dejavnikov:
a) spol: ženske imajo normalno višjo hitrost sedimentacije kot moški, za kar naj bi bili vzrok androgeni;
b) starost: hitrost sedimentacije se veča s starostjo, in sicer za 0,85mm/h na vsakih 5 let, kar je verjetno odraz povišanih nivojev fibrinogena; po menopavzi ženskam hitrost sedimentacije narašča hitreje kot moškim;
c) zdravila, npr. heparin in oralna kontracepcija;
d) nosečnost: najvišja hitrost naj bi bila 40-50 mm/h.

Hitrost sedimentacije je postal nekakšen sickness index, ker mnoge bolezeni vodijo v njeno povišanje. Najpogosteje se pojavi pri naslednjih boleznih:
- akutne in kronične infekcije, in sicer bakterijske bolj kot virusne, npr. pelvična vnetna bolezen, meningealna toksemija, infekcijski miokarditis in tuberkuloza;
- sistemske vnetne bolezni veziva, sklepov in žil, npr. revmatoidni artritis, polimialgija revmatika in temporalni arteritis;
- malignomi, npr. multipli mielom, Hodgkinova bolezen in bronhogeni karcinom, največkrat v napredovalnem stadiju bolezni;
- nekroze, npr. miokardni infarkt.

3. Močno zvišana hitrost sedimentacije
Izrazito povečanje pomeni hitrosti sedimentacije nad 100 mm/h. Močno zvišana hitrost sedimentacije je precej zanesljiv dokaz bolezni, približno 95, vendar s tem testom ne moremo ugotoviti, za katero bolezen gre. V različnih raziskavah so ugotovili, da je vzrok tako povišane hitrosti sedimentacije največkrat infekcija, sledijo avtoimunske sistemske vnetne bolezni, na 3. mestu so malignomi, v 2 povišane hitrost sedimentacije pa vzrok ni bil odkrit.