I. Beljakovine v krvni plazmi

Kri je sestavljena iz celic in krvne plazme. Po odvzemu se kri strjuje; če s centrifugiranjem odstranimo strjeni del, dobimo krvni serum. Kadar preprečimo strjevanje krvi tako, da dodamo antikoagulante (heparin, EDTA, oksalate…), po centrifugiranju dobimo krvno plazmo. Krvni serum se torej od plazme razlikuje predvsem po odsotnosti fibrinogena.

Koncentracija beljakovin v plazmi znaša okoli 70 g/l. Za karakterizacijo plazemskih proteinov se največkrat uporablja elektroforeza krvnega seruma. S to metodo ločimo različno nabite in različno velike molekule s pomočjo električnega toka. Naboj proteinov je odvisen od pH. Pri elektroforezi so beljakovine krvne plazme zaradi alkalnega medija negativno nabite, zato potujejo proti anodi. Hitrost potovanja je odvisna od njihovega naboja in sile upora, ki je sorazmerna velikosti in obliki molekul. Po obdelavi agaroznega gela z določenimi barvili so beljakovine vidne kot različno intenzivno obarvane frakcije na elektroforetski podlagi. Glede na optično gostoto prog, ki nam pove kakšna je absorpcija svetlobe posamezne frakcije (večja absorbanca-večji vrh), se z denzitometrijo izdela denzitogram. Iz njega lahko določimo količino beljakovin, tako da izračunamo površino posameznega vrha.

Na denzitogramu se normalno pokaže pet frakcij; albuminska, globulinska α1, α2, β in γ. Z izjemo albumina so te frakcije mešanice zelo različnih proteinov.













Slika 1: Elektroferogram in denzitogram krvnega seruma

(denzitogram nam pokaže delež posameznih frakcij, da pa bi dobili koncentracije posameznih frakcij, moramo najprej poznati skupno koncentracijo beljakovin, iz katere lahko z enakim razmerjem deležev izračunamo koncentracije posameznih frakcij).


Albumin

Predstavlja 55 – 60 vseh plazemskih proteinov in ima med njimi najmanjšo molekulsko maso. Njegovi najpomembnejši funkciji sta vzdrževanje onkotskega tlaka in transport različnih nizko-molekularnih snovi (bilirubin, maščobne kisline, zdravila).
Konstantna plazemska koncentracija albumina se vzdržuje prek sprememb:
1. hitrost sinteze albumina (nizek onkotski tlak poveča njegovo sintezo in obratno)
2. hitrost razgradnje albumina (hitrost razgradnje eksponentno narašča s plazemsko koncentracijo albuminov; pri nizkih koncentracijah albumina se razpolovni čas albumina podaljša, pri visokih pa skrajša)


Za ilustracijo navajamo nekaj najbolj znanih beljakovin drugih frakcij:

Globulini α1
• lipoprotein α1 (je količinsko najpomembnejši predstavnik te frakcije; prenaša lipide po krvi)
• α1-antitripsin (je inhibitor proteaze)


Globulini α2
• haptoglobin (veže hemoglobin sproščen iz poškodovanih eritrocitov)
• ceruloplazmin (veže baker)


Globulini β
• lipoprotein β (je količinsko glavna sestavina te frakcije; pomemben je pri prenosu holesterola)
• komponente sistema komplementa (devet komponent; C1-C9)
• transferin (služi prenosu železa)


Globulini γ
Frakcija je sestavljena iz imunoglobulinov, ki so protitelesa. Sestavljeni so iz dveh lahkih in dveh težkih verig, ki so sestavljene iz variabilnega in konstantnega dela. Verige so med seboj povezane z disulfidnimi mostički. Na variabilnem delu imajo specifično aminokislinsko sekvenco, kamor se veže en antigen oz. en epitop (ker ima en antigen lahko več epitopov, se praviloma aktivira več klonov plazmatk – poliklonalni odziv). Konstantni deli protiteles pa aktivirajo obrambo telesa (aktivacija sistema komplementa). Ločujemo jih glede na konstantne dele težke verige; IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Uspešna vezava antigena na receptor na površini plazmatke stimulira proliferacijo tistega klona plazmatk (te se diferencirajo iz B-limfocitov), ki izdeluje za antigen specifično protitelo.



II. Kvantitativne spremembe plazemskih beljakovin
(spremembe koncentracije)

Poznamo relativne in absolutne spremembe koncentracij plazemskih beljakovin. Relativna sprememba koncentracije je posledica spremembe volumna plazme, pri čemer je količina proteinov nespremenjena. Absolutna sprememba koncentracije pa pomeni spremembo količine plazemskih proteinov.




HIPERPROTEINEMIJA

Relativna: nastane pri dehidraciji zaradi zmanjšanja volumna plazme (značilno povečan hematokrit).
Absolutna: nastane zaradi povečane sinteze patoloških imunoglobulinov. Najpogosteje je to paraproteinemija (glej spodaj).

HIPOPROTEINEMIJA

Relativna: nastane ob zadrževanju vode v telesu (popuščanje srca, odpoved ledvic) ali zaradi prevelike infuzije.
Absolutna:
1. zaradi povečane izgube beljakovin; vzrok so lahko opekline, nefrotski sindrom ali bolezni prebavnega trakta (Crohnova bolezen)
2. zaradi zmanjšanje sinteze; vzrok so lahko bolezni jeter (ciroza, hepatitis) in malnutricija ali malabsorpcija. Sinteza albumina se zmanjša tudi pri infekcijah, poškodbah, kirurških posegih (glej citokinski odziv na stres).




III. Kvalitativne spremembe plazemskih beljakovin

1. Disproteinemija

S tem izrazom označujemo stanje, pri katerem se koncentracija plazemskih proteinov ne spreminja (je v mejah normale), spremenjeno pa je razmerje med posameznimi frakcijami. Najpogosteje je povišana ena ali več globulinskih frakcij na račun znižanja albuminov.

a) Disproteinemija pri akutnih boleznih

Pri akutnih boleznih in poškodbah, kot so na primer miokardni infarkt, kirurške operacije, nekroza, akutne infekcije, se sproži nespecifični (citokinski) odziv na stres. Zato se v jetrih poveča sinteza proteinov akutne faze, predvsem iz globulinskih frakcij α (haptoglobin, C-reaktivni protein, α1-antitripsin, komponente komplementa in druge), sinteza albumina pa se zmanjša. Posledično najdemo zmanjšano frakcijo albumina in povečani frakciji globulinov α1 in α2.

b) Disproteinemija pri kroničnih boleznih

V poznih fazah akutnega vnetja, pri malignih tumorjih, alergijskih in avtoimunih boleznih, kroničnih infekcijah, ter sistemskih boleznih veziva pride do spremembe v elektroferogramu:
poleg sprememb zaradi beljakovin akutne faze (povečani sta frakciji α1- in α2-globulinov ter zmanjšana frakcija albumina) se pojavi tudi poliklonska hiperimunoglobulinemija. Nastane zaradi povečane sinteze različnih imunoglobulinov kot odgovor na vdor antigenov (povečana frakcija globulinov γ - širok vrh na denzitogramu).
c) Disproteinemija pri kroničnih jetrnih boleznih

Pri kroničnih jetrnih boleznih (jetrna ciroza, kronični hepatitis) so običajno povišane koncentracije treh glavnih komponent imunoglobulinskega sistema (IgG, IgM, IgA - širok vrh globulinov γ na denzitogramu), zaradi vdora antigenov iz GIT prek portokavalnih anastomoz v sistemsko cirkulacijo. Znižani pa sta koncentraciji albumina in ß-frakcije zaradi propada hepatocitov.


e) Izgube beljakovin

Plazemske beljakovine lahko izgubljamo prek ledvic (nefrotski sindrom), prek gastrointestinalnega trakta in prek kože (pri opeklinah na velikih površinah).

NEFROTSKI SINDROM:
Gre za okvaro ledvic, pri kateri postane filter v glomerulih prepusten za proteine, predvsem za albumin. Pojavijo se proteini v urinu – proteinurija (na dan se z urinom izgubi 3,5 – 20 g proteinov in več).
Znižan onkotski tlak v plazmi zaradi pretežne izgube albumina z urinom povzroči pospešeno sintezo vseh beljakovin, tudi α2 in β frakcije globulinov, ki se zaradi večje molekulske mase manj izgubljata z urinom. Zato najdemo zmanjšano frakcijo albumina in zvečani frakciji α2 in β globulinov.


2. Izpad posamezne beljakovine

Gre za patološko stanje, pri katerem so posamezni proteini krvne plazme prisotni v spremenjeni obliki, ali pa sploh niso prisotni. Ponavadi so takšna stanja genetsko pogojena. Koncentracija manjkajoče beljakovine je ponavadi premajhna, da bi spremenila velikost frakcije pri elektroforezi, zato takšne spremembe diagnosticiramo glede na izpad funkcije ali z imunoelektroforezo.

Pomanjkanje α1-antitripsina
Zaradi mutacije se spremeni konformacija α1-antitripsina, ki se zato ne more izločati iz hepatocitov. α1-antitripsin je pomemben inhibitor proteaz, zato je pri tej bolezni povečana aktivnost proteaz v krvi in v tkivu. To povzroči propad elastičnih vlaken v pljučih in nastanek obstruktivne pljučne bolezni že pri mladih ljudeh (juvenilni emfizem).

Pomanjkanje ceruloplazmina (Wilsonova bolezen)
Anomalija se deduje avtosomno recesivno in je ena izmed pogostejših dednih bolezni. Ceruloplazmin je glavni prenašalec bakra, zato ob njegovem pomanjkanju baker hitro preide iz krvi v tkivo, hkrati pa se tudi izloča skozi ledvice. Zato je znižana plazemska koncentracija ceruloplazmina in bakra, zvišana vsebnost bakra v tkivih (možne okvare zaradi prostih radikalov) in pospešeno izločanje bakra s sečem. Pri odlaganju bakra v možgane, predvsem v bazalne ganglije se pojavijo ekstrapiramidalni sindromi, kot pri Parkinsonovi bolezni (tremor, rigor, nekoordinirani gibi), pri odlaganju v jetrih pa nastopi ciroza jeter.


3. Paraproteinemije (pojav patoloških imunoglobulinov)

Paraproteini so monoklonski imunoglobulini, ki se v fizioloških razmerah v plazmi sicer ne pojavljajo. Gre za patološko obliko imunoglobulinov, ki se ne sintetizirajo kot odgovor na antigenski stimulus. Če pride do nekontrolirane oz. maligne proliferacije enega klona plazmatk, le-te avtonomno sintetizirajo in tudi izločajo ustrezen monoklonski Ig. Ta ima lahko zgradbo popolnega Ig (največkrat IgG) ali pa je le posamezna veriga (lahka ali težka).
V denzitogramu plazme s prisotnimi paraproteini dobimo oster zobec M, ki ponazarja visoko koncentracijo monoklonskih molekul ene vrste, na področju γ-globulinske frakcije. Zaradi M zobca jim rečemo tudi M-komponente.
L-verižni paraproteini so lahko bodisi λ bodisi κ; zaradi svoje majhne relativne molekulske mase se izločajo preko ledvic. Temu rečemo Bence-Jonesova proteinurija. Ker se izločajo preko ledvic v plazmi praviloma niso v dovolj visoki koncentraciji za identifikacijo. Tam jih najdemo le pri ledvični insuficienci.



a) MONOKLONSKA IMUNOGLOBULINEMIJA (gamapatija) NEDOLOČENEGA POMENA

Pri bolezni so v plazmi prisotni monoklonski imunoglobulini (največkrat IgG, tudi IgA in IgM), vendar ni simptomov maligne bolezni, ker gre še za kontrolirano (benigno) proliferacijo plazmatk. Značilnosti, ki jo ločijo od maligne bolezni so:
- koncentracija monoklonskih imunoglobulinov v plazmi je manjša od 30 g/l
- delež plazmatk v kostnem mozgu je manjši od 10
- ni opazne Bence-Jonesove proteinurije
- na rentgenskih posnetkih niso vidne osteolizne poškodbe kosti
Pogostost bolezni s starostjo narašča, pogostejša je pri ljudeh starejših od 70 let.
Pri dlje trajajoči bolezni obstaja možnost preobrazbe v multipli mielom, kar se pojavi približno pri 20 obolelih.


b) MALIGNA MONOKLONSKA IMUNOGLOBULINEMIJA

Najpogostejši bolezni sta:

Multipli mielom (medularni plazmocitom) - gre za maligno proliferacijo enega klona plazmatk v kostnem mozgu, ki tvori paraproteine razreda IgG, redkeje IgA, IgE in IgM. Pogosto pa se pojavljajo tudi mono- ali dimeri lahkih verig.
Klinični znaki:
- osteoliza: tumorske celice preko citokinov aktivirajo osteoklaste in s tem osteolizo, kar vodi v hiperkalcemijo in krhkost kosti, zato prihaja do spontanih zlomov
- infekcije: paraproteini zavirajo sintezo, hkrati pa pospešijo razgradnjo fizioloških oblik Ig – posledično zmanjšana količina pravih Ig
- anemija: eritropoeza je zavrta zaradi velikega števila plazmatk v kostnem mozgu
- ledvična insuficienca: je posledica okvare tubulnega epitela zaradi visoke koncentracije L-verižnih paraproteinov v lumnu, hiperkalcemije in nalaganja amiloida
- nagnjenost h krvavitvam: zaradi interakcij paraproteinov s koagulacijskimi faktorji

Makroglobulinemija Waldenström - pojavlja se zaradi povečanega izločanja IgM iz neoplastičnih plazmatk. Ime makroglobulinemija se uporablja zato, ker se IgM imenujejo tudi makroglobulini. Bolezen prizadane vranico in limfatične organe in za razliko od multiplega mieloma ne povzroča poškodb kosti, hiperkalcemije in insuficience ledvic.
Klinična slika:
- hiperviskoznost krvi zaradi polimerizacije IgM
- hemolitična anemija



POSLEDICE PARAPROTEINOV V PLAZMI

1. Sindrom hiperviskoznosti

Povišana koncentracija proteinov, predvsem makroglobulinov lahko povzroči povečanje viskoznosti krvi, kar ima lahko za posledico motnje v krvnem obtoku v možganih, prstih, ledvicah ali v očeh. Očesno ozadje dobi karakterističen izgled z zelo razširjenimi venulami in pogostimi krvavitvami. Razvijejo se tudi znaki pešanja srca.

2. Krioglobulinemija
Krioglobulini so proteini, ki pri nizkih temperaturah kristalizirajo, pri visokih pa se ponovno talijo. Njihova prisotnost lahko privede do motenj v krvnem pretoku, ter posledično v nekrozo.

Klinična slika:
- Raynaudov fenomen: na mrazu prsti na roki postanejo bledi, nato cianotični in rdeči.
- Po izpostavitvi mrazu se lahko razvije tudi gangrena
Večina klinično pomembnih krioglobulinov so Ig, ki so lahko monoklonski (multipli mielom, makroglobulinemija) ali poliklonski (autoimune bolezni vezivnega tkiva).

3. Bence-Jonesova proteinurija

Bence-Jonesovi proteini so κ in λ lahke verige v plazmi (monomeri ali dimeri). Monomerne oblike se filtrirajo v glomerulih, resorbirajo v proksimalnih tubulih, višek pa se izloči z urinom. Pri prehodu skozi distalne tubule in zbiralca se lahko tvorijo dimeri, ki poškodujejo tubule, kar vodi v odpoved ledvic.
Bolezen se dokaže s testom koagulacije: pri segrevanju kislega urina na 40 do 60˚C se proteini obarjajo, vendar ponovno raztapljajo pri 90˚C. Zadnje čase jih dokazujemo z imunofiksacijo, ker je bolj občutljiva metoda.








IV. Sedimentacijska hitrost eritrocitov

Hitrost eritrocitne sedimentacije je enostaven laboratorijski test, ki se v kliniki uporablja že več kot 50 let. Po Westergrenovi metodi se krvi doda antikoagulant (natrijev citrat) in se jo posrka v cevko. Cevko se pusti stati v pokončnem položaju eno uro. Rezultat testa predstavlja razdalja od stebrička eritrocitov do vrha krvne plazme in se izrazi v milimetrih na uro. Normalne vrednosti znašajo za ženske manj kot 25 mm/h, za moške pa manj kot 16mm/h. Zgornjo mejo dobimo tako, da za moške leta starosti delimo z 2, za ženske pa tako, da letom starosti prištejemo 10 in nato delimo z 2.

Eritrociti in vitro sedimentirajo, ker je njihova gostota večja od gostote plazme.
Plazma je viskozna tekočina, zato padanju eritrocitov nasprotuje sila upora, ki je odvisna od hitrosti padanja eritrocitov, viskoznosti plazme in oblike eritrocitov (Stokesov zakon). Pri določeni hitrosti se sila upora izenači s silo težnosti in hitrost sedimentacije postane konstantna. Če se poveča hidrodinamičnost eritrocitov (zaradi zlepljanja), se bo isti upor dosegel pri večji hitrosti.
Hitrost sedimentacije je torej odvisna od eritrocitnega zlepljanja (agregacije) in tvorbe stebričkov (rouleaux). Normalno so eritrociti v plazmi ločeni zaradi negativnega naboja, ki ga imajo eritrociti na svoji površini in zaradi tega se med sabo odbijajo. Zlepljanje eritrocitov povzročajo plazemske beljakovine, ki se vežejo nanje in nevtralizirajo negativni naboj na površini eritrocitov. Pri tem ima pomembno vlogo fibrinogen, polovico njegove moči pa imajo globulini α in γ, zato najbolj vplivajo na zvišano hitrost sedimentacije eritrocitov beljakovine akutne faze citokinskega nespecifičnega odgovora na stres.


SEDIMENTACIJA ERITROCITOV V KLINIČNI PRAKSI
Rezultat hitrosti sedimentacije eritrocitov ponuja zdravniku 3 vrste informacij:
a) kaže na prisotnost ali odsotnost bolezni,
b) odraža napredovanje ali izboljšanje že prepoznane bolezni in
c) omogoča izmeriti odziv na terapijo.

Znižana vrednost nima pomena, pri zvišani hitrosti sedimentacije nad 100mm/uro pa je verjetnost, da bolezensko stanje obstaja, zelo velika. Za katero bolezen točno gre ne moremo vedeti, potrebne so še dodatne diagnostične preiskave. Na zvišano hitrost sedimentacije eritrocitov normalno vplivajo spol (ženske višja kot moški), starost (z leti narašča), nekatera zdravila (heparin, oralni kontraceptivi – se poveča) in nosečnost (se poveča).
Hitrost sedimentacije tipično zvišujejo bolezni, ki sprožijo citokinski odziv na stres (beljakovine akutne faze):
- infekcije (endokarditis, tuberkuloza)
- autoimunske sistemske bolezni veziva (revmatoidni artritis, temporalni arteritis)
- malignomi (multipli mielom, bronhogeni karcinom) – predvsem v napredovani fazi
- nekroze (miokardni infarkt).

Test v zadnjem času nadomešča merjenje C-reaktivnega proteina ( CRP-beljakovina akutne faze).