Uvod

V laboratorijih uporabljajo različne metode za dokazovanje okužb z bakterijami. V zadnjem času se posrednim in neposrednim metodam pridružujejo tudi molekularne metode.


Vsebina (Naslovi podpodglavij)

MOLEKULARNE METODE

Z razvojem molekularnih metod je znanstvenikom uspelo prenesti te metode v diagnostične laboratorije, kjer jih danes uporabljajo vsakodnevno. Pomembne so predvsem za odkrivanje zgodnjih okužb(1,3).
Uporabnost posamezne metode je povezana z njeno specifičnostjo, to je sposobnost ločevanja določenega antigena ali protiteles od drugih antigenov in protiteles, in občutljivostjo, to je najmanjša koncentracija določenega antigena ali protitelesa, ki ga metoda zazna(1,3).
Z molekularnimi metodami dokazujemo prisotnost nukleinskih kislin bakterij v kužnini. Zato je prvi korak osamitev DNA ali RNA iz vzorca. Temu sledi dokazovanje za kar se uporablja več metod, to so sekvenčna analiza, hibridizacijske metode in metode pomnoževanja delcev nukleinskih kislin(1).
Sekvenčno analizo se ne uporablja v rutinske namene, ker je zamudna, draga in tehnično zahtevna(1).
Hibridizacijske metode temeljijo na denaturaciji pri visoki temperaturi in renaturaciji ali hibridizaciji, pri kateri uporabimo označene lovke, to so oligonukleotidi katerih zaporedje poznamo, zato lahko po končani metodi določimo zaporedje preiskovanega genoma. Poznamo več tipov hibridizacije. Southern hibridizacijo uporabimo ko dokazujemo DNA, za lovke lahko uporabimo kratke sekvence označenih DNA ali RNA. Northern hibridizacijo uporabimo za dokazovanje RNA, lovke so označene kratke sekvence RNA ali DNA(1).
Metode pomnoževanja delcev nukleinskih kislin nam pomnožijo določen kratek del DNA ali RNA značilnega za določeno bakterijo. Za več kot miljon kopij potrebujejo le nekaj ur. Za uspešno pomnoževanje pa je nujno potrebno poznavanje vsaj dela genoma, kar nam omogoča pravilno izbiro začetnega oligonukleotida (primer), ki je komplementaren mejnemu delu tistega dela genoma, ki ga želimo pomnožiti. Tudi tu poznamo več tipov. Najstarejša je verižna reakcija s polimerazo (PCR), pri kateri uporabimo samo encim temperaturno obstojno polimerazo DNA. Pri klasični reakciji lahko pomnožimo samo DNA, če dokazujemo RNA, je predhodno potrebna reakcija z reverzno transkriptazo, da dobimo cDNA. Po končanem postopku sledi elektroforeza, da dobimo delce pomnožene DNA razporejene gleda na velikost in v primeru da dobimo veliko fragmentov katerih velikost ustreza velikosti fragmenta bakterijske DNA, ki jo iščemo, lahko potrdimo okužbo. Pri verižni reakciji z ligazo (LCR) se uporabijo 4 primerji, uporabi se temperaturno obstojna ligaza DNA, odsek med primerjema pa je krajši, od 1 do 5 nukleotidov(1).


VLOGA MOLEKULARNIH METOD PRI DOKAZOVANJU POSAMEZNIH BAKTERIJSKIH OKUŽB

Chlamydia trachomatis spada med po Gramu negativne bakterije, je znotrajcelični parazit, zato so jih dolgo uvrščali med viruse. Je najpogostejši povzročitelj spolno prenosljivih bolezni, pri moškem povroča 30-50 uretritisov, epididimitis, pri ženskah pa cervicitis in uretritis, če okužbe ne zdravimo pa tudi endometritis, salpingitis, vnetja v mali medenici, zunajmaternično nosečnost, sterilnost in artritis. Z rokami se jo lahko prenese v oči in v primeru sekundarne okužbe z drugimi bakterijami lahko pride do slepote. Dokazuje se jo z neposredno imunofluorescenco, testom ELISA, serološkimi testi in v zadnjem času z molekularnimi metodami(2).
Metode dokazovanja C. trachomatis, pri katerih potrebujemo kulturo, so 30 manj občutljive kot metode molekularnega dokazovanja, za katere zadostuje vzorec urina, kar je najbolj enostaven način za pridobitev kužnine, uporabi pa se prvi curek. Pomankljivost pa je sicer majhna možnost neupravičeno pozitivnega rezultata, možnost kontaminacije, ki pa je majhna. Test lahko kombiniramo z metodami za dokazovanje Neisseriae gonorrhoeae in je vzorčni primer za razvijanje novih molekularnih metod tudi za druge bakterije(3).

Neisseria gonorrhoeae spada med po Gramu negativne koke, povzroča pa pogosto spolno prenosljivo bolezen gonorejo. Njeno naravno okolje so sluznice sečil, spolovil in očesne veznice. Pri moških pride do uretritisa in gnojnega izcedka iz sečnice, pri ženskah pa vnetje sluznice materničnega vratu in sečnice z gnojnim izcedkom, lahko pa se razširi na jajcevode in jajčnike, kar naredi jajčnike neprehodne. Razvili so mehanizem s katerim se izmikajo imunskemu sistemu, kar dosežejo s spreminjanjem beljakovin na površini. Za diagnostiko se uporabljajo mikroskopski pregled razmaza kužnine, pri čemer pa negativen rezultat pri moških še ne zadustuje za postavitev diagnoze, pozitiven pa je dovolj za antibiotsko zdravljenje, pri ženskah pa mikroskopski pregled ne zadostuje, potrebna je tudi osamitev in identifikacija. V zadnjem času se uporabljajo tudi molekularne metode(2).
Ob primernem prenosu je občutljivost kulture enaka molekularnim metodam, specifičnost brez potrditvenega testa ni popolna. Pri molekularnih metodah lahko pride do križanja z drugimi Neisseria spp., časovno pa je veliko bolj ugodna od ostalih metod(3).

Mycobacterium tuberculosis povzroča tuberkulozo, parazitira v pljučih in drugih organih, prenaša se kapljično. Okužba je bolj pogosta od bolezni, okuži se 25-50 ljudi, zboli jih le 10. Tuberkuloza se lahko hitro razširi, en bolnik lahko okuži mnogo ljudi, zato je pomembno hitra prepoznava. Uporabljajo se mikroskopski preparati in dokazovanje s kulturo, v zadnjem času tudi molekularne metode(2).
Ker se tuberkuloza hitro širi je pomembno hitro odkritje okužbe. Najprej se uporabijo mikroskopski preparati, za kar potrebujemo 103-105 bakterij na mililiter kužnine in če dokažemo da gre za tuberkulozo, z molekularno metodo določimo ali gre za tipično okužbo, ki jo povzroča M. tuberculosis, ali za atipično. Tudi za molekularne metode potrebujemo 103-105 bakterij na mililiter kužnine, ker se nahaja v sputumu, ki ga uporabimo, veliko inhibitorjev, ki onemogočijo delo encimom za podvojitev. Pomembno pa je, da se lahko pošljejo samo vzorci ljudi, ki predhodno niso bili okuženi s to bakterijo. Ker občutljivost za to bakterijo ni 100, je potrebno vzporedno vzgojiti tudi celično kulturo, kar pa traja 8 tednov(3).

Bordetella pertussis je po Gramu negativna bakterija, katere edini gostitelj je človek. Povzroča oslovski kašelj, prenaša se kapljično. Kljub temu, da so otroci cepljeni proti tej bakteriji, se z njo lahko okužimo. Cepivo je najbolj zanesljivo pri precepljenem otroku starem okoli enega leta, potem pa je zanesljivo še 5-10 let. Adolescentniki in odrasli so tako dovzetni za okužbo, če se v zraku nahaja dovolj te bakterije(2).
Za identifikacijo se uporablja metoda osamitve in identifikacije, imunofluorescentne preiskave, serološke metode, po novem pa tudi molekularne metode. Pri tej bakterije je za izbiro prave metode pomemben čas odvzema kužnine. Če jo odvzamemo v kataralnem obdobju ali ob koncu inkubacijske dobe, so molekularne metode bolj občutljive kot kultura, ki za rast potreduje 7 dni, da da negativen rezultat. cepljenje otrok. Na tržišču ni komercialnega molekularnega testa, ampak se ta test dela po protokolih laboratorija. Kasneje se okužbo dokazuje s serološkimi metodami, katerih problem je predhodno (3).

Borrelia spp. so skupina spiralnih bakterij, ki povzročajo pri človeku mrzlico in lajmsko boreliozo. Gostitelji so pogosto mali glodalci, prenašajo pa jih členonožci (klopi). Diagnozo lajmske borelioze je težko postaviti, ker ni primernih testov, ki bi dokazali aktivno obliko bolezni, niti nista njihova občutljivost in specifičnost zadovoljivi. Kultura se razvija počasi, zahteva posebno pripravljen medij in ni dovolj občutljiva. Trenutno najbolj primeren test je PCR kožnega tkiva, je namreč najbolj občutljiv in specifičen. PCR pa ni primeren pri neuroboreliozah saj je B. burgdorferi redko prisoten v cerebrospinalni tekočini, zato je tu bolj primerno štetje nastalih protiteles, ki je bolj občutljivo(2,3).

Helicobacter pylori je po Gramu negativna spiralna bakterija, ki kolinizira v človekovem želodcu. Z njo je okuženega 50 prebivalstva, prenaša pa se s slino, okuženo pitno vodo in okuženim endoskopom. Sama okužba lahko vztraja leta, le redko spontano izgine. Povzroča gastritis in ulkus duodenuma(2,3).
Za prepoznavanje se uporablja več tehnik, kultivacija in identifikacija (kultivacija je pomembna za ugotavljanje odpornosti na antibiotik), serološke tehnike in molekularne metode, za katere lahko uporabimo želodčni sok ali iztrebke v katerih dokazujemo encim ureazo in toksina citotoksični protein ter vakuolizirajoči toksin. Slaba lastnost molekularnih metod je slaba občutljivost(3).

Mycoplasma pneumoniae je bakterija brez celične stene. Povzroča pljučnice in okužbe sklepov, prenaša se kapljično(2).
Za prepoznavo se uporablja osamitev in identifikacija, ker nima celične stene, je zelo zahtevna bakterija, kultivacija traja 2-6 dni. Uporabljajo se tudi serološke metode in molekularne metode, ki so najbolj občutljive, najhitrejše in identificirajo posamezno vrsto. S PCR ugotavljamo prisotnost gena za adhezin P1(3).

Chlamydia pneumoniae je kot C. trachomatis znotrajcelični parazit, je zelo razširjena, prenaša se kapljično. Povzroča 6-25 pljučnic, 10-20 kroničnih bronhitisov in 5-10 infekcij zgornjih dihalnih poti(2).
Za prepoznavo se uporabljajo serološke metode, v zadnjem času tudi molekularne in sicer PCR, slaba lastnost pa je ta, da nista poznani specifičnost in občutljivost(3).

Legionela spp. je skupina po Gramu negativnih bakterij, katerih glavno bivalno okolje je voda, parazitira predvsem v amebah. Povzroča pljučnice, predvsem L. pneumophila(2,3).
Prepoznavamo jo z metodo osamitve in identifikacije, kar traja 2-5 dni, neposredno imunofluorescenco z monoklonskimi protitelesi, dokazovanjem antigena v seču, s serološkimi metodami in dokazovanjem nukleinskih kislin v bronhoalveolarnih izpirkih, sputumu in trahealnimi aspirati(3).



Streptococcus pneumoniae je po Gramu negativna bakterija, ki se prenaša kaplično in s slino. Povzroča pljučnico, bronhitis, vnetja srednjega ušesa in obnosnih votlin, meningitis, bakteriemio, sepso in peritonitis(2).
Povzročitelja dokazujemo z metodo osamitve in identifikacije, z neposredno mikroskopsko preiskavo vzorcev kužnine (barvanje po Gramu kužnine pacienta predhodno nezdravljenega z antibiotiki). Molekularne metode so za dokazovanje te okužbe zelo pomembne, saj jo z njimi lahko dokažemo tudi pri človeku, ki je že bil predhodno zdravljen z antibiotiki. Te metode so dolgo časa raziskovali, saj bakterija povzroča raznolike bolezni(2,3).


Zaključek

Z napredkom znanosti nam je uspelo molekularne metode prenesti v laboratorije. Primerne so ko potrebujemo hitro diagnozo zaradi narave bolezni, za odkrivanje zgodnjih okužb, navadno so tudi bolj občutljive in specifične od ostalih metod.


Literatura

1. Koren S., Avšič Županc T., Drinovec B., Poljak M. Splošna medicinska virologija. Ljubljana: medicinski razgledi, 1998
2. Gubina M., Ihan A. Medicinska bakteriologija z imunologijo in mikologijo. Ljubljana: Medicinski razgledi, 2002
3. Persing D.H., Tenover F.C., Versalovic J., Tang Y.W., Unger E.R., Relman D.A., White T.J. Molecular microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington D.C.: ASM Press, 2004