UVOD

Genska terapija v osnovi pomeni vnos normalnega oziroma s pravilnim zapisom gena (terapevtski gen) v celice bolnika, kjer nadomesti okvarjen ali manjkajoči gen. Če je npr. okvarjen gen, ki zapisuje protein, pomemben za delovanje celice, se lahko to izraža kot huda oblika bolezni. Tak primer je bolezen srpastih eritrocitov, ki je posledica mutacije β-verige hemoglobina, zaradi česar se tako spremenijo struktura in lastnosti rdečih krvnih celic, da se med sabo lepijo in mašijo žile. Na drugi strani je mogoče z gensko terapijo preprečiti delovanje kakega škodljivega gena in zdraviti kronične virusne okužbe, kot tudi raznolike okvare, ki so povezane z uravnavanjem funkcij kot so celični cikel, apoptoza in imunski sistem. Mogoče pa je tudi vnašati t.i. samomorilne gene, ki v kombinaciji s primernimi spojinami povzročijo smrt celic, v katere so bili vneseni. Ta pristop, denimo, poskušajo uporabiti pri zdravljenju raka.

Največji izziv genske terapije je učinkovit in varen vnos gena v celice. Pri tem je treba najprej premostiti celično membrano, ki kot nekakšen zid ščiti celico pred zunanjostjo. Ko je gen v celici, ga je treba spraviti še v jedro, »centralni štab« celice, da sploh lahko postane aktiven. Hkrati vnos gena ne sme povzročiti stranskih učinkov, kar pa je zaradi kompleksne biologije človekovega telesa zelo težko doseči. Znanstveniki vnašajo gene v celice s pomočjo prenašalci, ki jih imenujejo vektorji. Vektor je transportno sredstvo, ki omogoča vstop genov v celico in po možnosti v njeno jedro. Okvirno lahko vektorje razdelimo na virusne in nevirusne, vsak tip vektorja pa ima svoje prednosti in pomanjkljivosti - prav tako kot običajna transportna sredstva, ki jih uporabljamo v vsakdanjem življenju.

Največji problem pri genski terapiji ostaja dejstvo, da nimamo univerzalnega vnašalca. Čeprav se za vnos genov veliko uporabljajo virusni vektorji kot so adenovirusi, AAV (adeno associated virus) in retrovirusi, ki so učinkovit vnosni sistem, se pri tem pojavljajo težave, kot so na primer veliki stroški povezani s proizvodnjo teh vektorjev. Prav tako njihova velikost vpliva na izbran ekspresijski sistem in vključitev pomembnih regulatornih elementov za transgene. Pri dlje časa trajajoči terapiji lahko pride do reakcije imunskega sistema. Vnos z adenovirusom, ki se ne vgradi v genom, ima za posledico samo omejeno trajanje izražanja gena. To je lahko precej pomembna pomanjkljivost, če motnja zahteva dosmrtno izražanje funkcionalnega gena. V nasprotju z adenovirusi se retrovirusi vgradijo v gostiteljski genom in izvršujejo dolgoročno izražanje, vendar je za vgradnjo gena potrebna delitev celice, kar predstavlja oviro pri nekaterih oblikah somatske genske terapije. Vgraditev gena poteka naključno, kar lahko povzroči vgraditev gena na funkcionalno pomembno mesto DNA in s tem prekine normalno izražanje za organizem pomembnega gena.

JETRA KOT TARČNI ORGAN

Različnost nepravilnosti v jetrih naredi jetra za privlačno tarčo genske terapije. Jetra imajo mnogo lastnosti, zaradi katerih so edinstven tarčni organ za gensko terapijo. Sposobnost kompleksov, da zapustijo žilo je odvisna od velikosti fenester med kapilarnimi endotelijskimi celicami, prav tako pa tudi od velikosti in obremenitve kompleksov. Kapilarne fenestre so zelo pomembne v jetrnih sinusoidih in dovoljujejo prosto prehajanje kompleksov manjših od 100 nm v Dissejev prostor. Velik volumen venskega izliva čez hepatične vene zagotavlja efektivno sekrecijo in biodistribucijo transgenih produktov. Asialoglikoproteinski receptorji so edinstveni in se predstavljajo v visoki gostoti na hepatocitni površinski membrani. Receptor veže galaktozne ostanke, kar sproži receptorsko posredovano endocitozo. Jetra so lahko "tarčna" in situ ali so hepatociti izolirani, obravnavani ex vivo in nato vrnjeni v gostitelja.

NEVIRUSNI GENSKI VNOS

GOLA DNA

Gole DNA, injicirane v sistemsko cirkulacijo, se telo hitro znebi ravno preko mehanizmov v jetrih. Pri tem imajo veliko vlogo Kupfferjeve celice. Biodistribucija gole DNA je omejena zaradi učinkovitega posredovanja jeter in zaradi hitre razgradnje z nukleazami v krvnem obtoku. Direkten vnos gole plazmidne DNA je sicer imel določen uspeh, a je bilo izražanje gena nizko in kratkotrajno.

VNOS DNA V KOMPLEKSIH

V zadnjem desetletju so se razvile tri glavne kategorije ne-virusnih sistemov za sistemski prenos nukleinskih kislin:
Polipleksni sistemi predstavljajo komplekse tvorjene z dodajanjem nukleinskih kislin kationskemu polimeru. Ti polikationsko-bazirajoči vnosni sistemi, kot so poli-L-lizin (PLL), polietilenimin (PEI), poliglukozamini, lipopoliamini in kationski peptidi, tvorijo vodotopne komplekse, ki zato predstavljajo preproste in izredno učinkovite sisteme za gensko dostavo in vitro.
Lipopleks vsebuje kationski lipid in DNA. Vezava negativno nabite molekule DNA je stabilizirana zaradi pozitivnih nabojev na lipidu. Priprava lipopleksov je razmeroma enostavna, imunskega odziva ni. Če so lipidi usmerjeni v hepatocite, je pomembno, da niso večji od 100 nm, saj drugače ne bi mogli v Dissejev prostor.
Lipopolipleks vsebuje kationski lipid, polikationske polimere in DNA. So vnosni sistemi, ki nastanejo z zgoščevanjem DNA (z veliko molekulsko maso) s polikationi in lipidno kapsulacijo, ki sledi kondenzaciji. Tako je v sredini DNA, skorja pa je iz lipidov. Dva poglavitni prednosti lipopolipleksa pred lipopleksom sta zmanjšana velikost partikla in večja zaščita nukleinskih kislin pred nukleazno razgradnjo.
Na žalost pa te NK/kationski kompleksi zaradi svoje velikosti velikokrat kažejo določeno mero toksičnosti in zmanjšajo učinkovitost transfekcije (vnašanje tuje molekule DNA v celico, ki mu sledi ekspresija enega ali več genov).
Celična toksičnost teh kationskih kompleksov je odvisna od velikosti delcev in od višine pozitivnega zeta potenciala, ki je potreben za nespecifičen vnos kompleksa v celico. Serumski proteini zmanjšujejo uspešnost transfekcije in vitro in in vivo, delno zaradi nevtralizacije pozitivnega zeta potenciala potrebnega za nespecifičen vnos kompleksa. Interakcija s serumskimi proteini prav tako zmanjša učinkovitost s povečanjem velikosti delcev na več kot 100 nm (›100 nm), na ta način zniža prehod skozi fenestre in prav tako tudi inhibira endocitozo. Kompleksi postanejo bolj dovzetni za vnos in razgradnjo v retikuloendotelijskem sistemu. Toksičnost NK/kationskih kompleksov so znižali tako, da so kationske komplekse zaščitili s polietilenglikolom (PEG). To je hidrofilna molekula, ki preprečuje agregacijo kompleksov, jih stabilizira in ohranja velikost potrebno za endocitozo in preprečuje vezavo serumskih proteinov. Slabost tega ščitenja kationskega naboja s PEG je v zmanjšani uspešnosti transfekcije.

VNOS DNA V HEPATOCITE

Da bi premagali te ovire, so bili nekateri prenašalni sistemi spremenjeni z ligandi za receptorsko posredovano endocitozo. Kot primer: ker imajo samo hepatociti na membrani vezan asialoglikoproteinski receptor, lahko specifično usmerimo DNA tako, da na PLL, PEI ali lipopoliamine konjugiramo asialooromukoid in galaktozo. Prav tako se ligand/receptorsko posredovana endocitoza izogne potrebi po celotnem neto pozitivnem naboju. Dejansko pa negativno nabiti delci pospešujejo bolj učinkovit ligand/receptorski posredovan vnos nukleinske kisline. DNA vstop v celice preko »normalne« endosomalne poti izboljša jedrno translokacijo tuje DNA v jedro. Vstavljanje v hepatocite bi lahko bilo doseženo tudi s prenosom kompleksov po krvi, ki prihaja v jetra: ali preko portalne vene ali hepatične arterije, in bi lahko znižala potencialne sistemske stranske učinke.
Selektiven jetrni arterijski prenos pa bi lahko bil koristen tudi pri specifičnem usmerjanju v tumorje. Npr. večina primarnih jetrnih tumorjev ima izdatno in nenormalno prepustno krvno oskrbo, ki bi lahko bila ugodnejša za genski prenos.


VPLIV NA PORAZDELITEV TUJE DNA ZNOTRAJ CELICE

PEI in drugi polikationi se tako uspešno uporabljajo za zgoščevanje in zaščito DNA pred razgradnjo z nukleazami (=fosfodiesteraze, ker hidrolizirajo fosfodiesterske vezi visokomolekularnih nukleinskih kislin-DNaze, RNaze).
Razni peptidi namreč pospešujejo prehod DNA iz endosoma v citosol. Eden takih je hemaglutinin HA2 (protein virusa gripe), ki se v kislemu okolju endosoma konformacijsko spremeni in ustvari amfipatični -heliks. Tako se lahko spoji z endosomalno membrano, jo uniči, in omogoči sprostitev DNA iz endosoma v citosol. PEI pa najverjetneje deluje na način počasi sproščajočega sistema, saj v endosomu vztraja dalj časa.

Ko je DNA sproščena v citosol, na vstop v jedro vplivajo njena velikost ter vrsta in velikost vnašalca (delivery agent). Prehod v jedro pa lahko izboljšamo tako, da v plazmidni konstrukt dodamo jedrni lokalizacijski signal (NLS = nuclear localization signal).
Dandanes pa znajo dostaviti molekule tudi v mitohondrije - prav tako na osnovi prepoznavanja specifičnih privzemnih (uptake) signalov. Prav mutacije na mitohondrijski DNA pa imajo osrednjo vlogo pri mnogih jetrnih okvarah. Mitohondrijska genska terapija bi tako lahko sčasoma postala terapevtska metoda.

VLOGA RIBOCIMOV, ANTISENSE INHIBICIJE IN DNA RIBONUKLEAZ PRI GENSKI TERAPIJI (slika 5)
Raziskave novih načinov zdravljenja temeljijo na vplivu na nukleinske kisline-predvsem na mRNA. Te metode naj bi tako inhibirale funkcijo ali ekspresijo virusnih genov.

RIBOCIMI

Ribocimi so encimi RNA (večinoma le iz molekul RNA, kompleksnejši pa imajo še proteine), ki se vežejo na specifična zaporedja RNA substratov in katalizirajo endoribonukleolitični razcep. Njihov substrat je ponavadi molekula RNA, ki je lahko tudi del samega ribocima.

Tvorijo specifično sekundarno strukturo-hairpin (lasnica) ribocim in hammerhead ribocim. Centralni del predstavlja reaktivni del in sodeluje v direktni cepitvi tarčne RNA. Domene ali heliksi ribocimov, katerih bazni pari se ujemajo s substratnimi in služijo za vezavo, so funkcionalno ločeni od reaktivnih delov, ki vplivajo na cepitev. Tako lahko z modificiranjem teh vezavnih delov izbiramo, kam se bo ribocim vezal. Celica nato nastale fragmente RNA hitro razgradi, kar naredi molekulo nefunkcionalno, saj se gen ne more izraziti.
Raziskave na tej osnovi so omogočile usmeritev ribocimov na virusno RNA pri infekcijskih boleznih, na dominantne onkogene v rakastih celicah in specifične somatske mutacije pri različnih genetskih nepravilnostih. In ker so ribocimi lahko sintetizirani ex vivo in pakirani za celični vnos, ali pa izraženi šele v jetrih po vnosu genov zanje, imajo potencialno prednost pred drugimi tehnologijami. Njihovo delovanje je tudi dolgotrajno-več tednov po ekspresiji in več dni po direktnem vnosu v krvni obtok.



Ribocimi so potencialno uporabni pri zdravljenju hepatitisa B in C, hiperlipidemije (na osnovi razgradnje mRNA za apolipoprotein B), ateroskleroze in črevesnega raka (z razgradnjo mRNA za receptorje vaskularnega endotelijskega rastnega dejavnika).


RIBONUKLEAZE DNA

Presenetljiv uspeh z ribocimi je pripeljal do razvoja novega koncepta ribonukleaz DNA. Ribonukleaze DNA so katalitske mulekule, ki so sestavljene iz umetne enojne DNA verige, ki specifično cepi substratno RNA na način, ki je analogen ribocimom. Podobno kot ribocimi imajo ribonukleaze tri domene. Dve, ki prepoznata substrat in se vežeta na tarčno RNA, tretja pa je katalitična domena, ki sestoji iz 15 nukleotidov. Te molekule imajo proti v primerjavi z ribocimi kar nekaj pomembnih prednosti:
lažje jih je pripraviti in vstaviti v celice,
so manj občutljive na kemično in encimsko razgradnjo,
imajo večjo katalitsko učinkovitost.

Kationski lipidni vnos teh DNA analogov ribocimov, ki so usmerjeni proti genomu virusnega hepatitisa C, ki ima za posledico specifično razgradnjo tarčne RNA in inhibicijo virusnega podvajanja. Ribonukleaze DNA so uspešne tudi pri vnosu virusne RNA hepatitisa B, s tem pa pomembno inhibirajo znotraj celično izražanje virusnega gena.


INHIBICIJA S PROTISMISELNIMI OLIGONUKLEOTIDI

Če torej želimo zmanjšati količino kakega proteina, moramo prekiniti transkripcijske ali posttranskripcijske dogodke. Pri tem najlažje izkoristimo m-RNA, ki je v celici prisotna večinoma v enoverižni obliki. Če namreč v celico uspemo vnesti verigo RNA (protismiselni oligonukleotid), ki je komplementarna m-RNA (za protein, ki se ga želimo znebiti), bo nastala dvoverižna RNA, in translacija tarčnega zaporedja ne bo potekala.

Antisense oligonukleotide za hepatitis B ali C so vstavili v HuH 7 človeških hepatoma celic z uporabo asialoglikoproteina, ki je bil povezan s polilizinom (ASGP-PLL). Vnos ribocima z oligonukleotidi komplementarnimi tisti regiji virusa hepatitis C, ki nadzira njegovo translacijo, pa je povzročil inhibicijo razmnoževanja tudi tega virusa.


















Nedavno poročilo opisuje tudi vnos dvoverižnih oligonukleotidov, ki so jih ustvarili za blokiranje vezavnih mest znotraj regij genskega promotorja za transkripcijski faktor NF-Κb (pomembno vlogo ima pri regulaciji genov, ki imajo vlogo pri inflamatornih in imunskih odgovorih ter celičnem preživetju in rasti). Ta mamljiva strategija je povzročila zmanjšanje sekrecije pro-inflamatornih citokinov, ki so jo povzročili z intravenozno injekcijo tumorskih celic, prav tako pa tudi pomembno zmanjšanje tumorske rasti jetrnih metastaz.

SKLEP

Ta pregled prikazuje osrednjo vlogo jeter v genski terapiji v prihodnosti. Potrebno bo premagati še mnogo ovir, glavna med njimi je vsekakor uspešno vstavljanje virusnih vektorjev v celico. Razviti so številni novi pristopi za izboljšanje teh zahtev za uspeh. Npr.: konjugacija oligonukleotidov s translokacijskimi membranskimi peptidi lahko zagotovi alternativne poti v jedro, ki obidejo določene endosomalne kompartmente. Končno se to pokaže v zmanjšani encimski razgradnji in vnosu zmanjšanega števila molekul v jedro. Model sistemskega vnosa bi lahko zamenjal lokalni jetrni vnos, kar pa naj bi zmanjšalo količino potrebnih molekul/prenašalcev, in tako potencialno zmanjšal sistemsko toksičnost.