Genska ekspresija je regulirana na več nivojih, ne samo na stopnji transkripcije. Med pomembnimi posttranskripcijskimi procesi ima obračanje RNA zelo pomembno vlogo. Stabilnost molekule mRNA v citosolu evkariontskih celic je povečana z dodatkom poli-A verige na 3 koncu pri prokariontih pa ta proces povzroči ravno nasprotni učinek, in sicer hitrejši razpad molekule RNA. V mitohondrijih pa je situacija drugačna. Evolucija predvideva, da poliadenilacija prispeva k pospešeni razgradnji RNA, ki jo povzročajo nukleaze in drugi dejavniki, a so raziskave pokazale, de je uravnavanje obračanja mitohondrijske mRNA pri različnih vrstah različno.

Organizacija in vsebina mitohondrijskega genoma je zelo različna pri različnih evkariontih, ne glede na to, da imajo verjetno enakega skupnega predhodnika in enako biološko funkcijo. Poleg teh razlik pa se pri različnih vrstah pojavljajo tudi različni mehanizmi uravnavanja izražanja mitohondrijske DNA, še posebej so ti mehanizmi različni pri nadzoru stabilnosti mRNA.

Razgradnja RNA je ključni proces, ki je vključen v kontrolo količine danega prepisa, potreben za odstranitev produktov, ki so nastali pri zorenju molekul RNA in nepravilnih prepisov. Raziskave kažejo, da so določeni encimi, ki so vključeni v razgradnjo mitohondrijskih RNA delno ohranjeni pri različnih organizmih. Način njihovega delovanja pa je postal med evolucijo drugačen. Primer je že omenjena poliadenilacija, ki ima pri različnih vrstah različno vlogo.

Razgradnja RNA v mitohondrijih

Prve encime, ki razgrajujejo mitohondrijsko RNA, so odkrili pri kvasovkah. V biogenezo mitohondrijev je vključenih mnogo različnih genov. Produkt gena jedrnega SUV3 je SUV3p (p – protein), to je RNA helikaza, ki je podenota velikega proteinskega kompleksa mtEXO, ki kaže od NTP odvisno eksoribonukleolitično aktivnost. Ta kompleks se poveže z mitoribosomi, poleg SUV3p pa kompleks vsebuje tudi Dss1p, specifično eksoribonukleazo za enojno verigo. Kompleks mtEXO, odvija dvoverižno mitohondrijsko RNA in posledično razgrajuje RNA v smeri od 3 → 5 koncu. Pravijo mu tudi kvasovkin mitohondrijski degradosom, ker je zelo podoben RNazi in RNA helikazi pri bakterijah, ti dve imata podobno vlogo. Med vrstama organizmov je razlika v tem, iz koliko in kakšnih podenot je kompleks sestavljen.

In vitro poskusi kažejo, da so produkt razgradnje z mtEXO mononukleotidi, vendar razgradnja ne doseže 5 konca. Tako ostane kratek oligoribonukleotid nerazgrajen. Torej je v pogojih in vivo potrebna še ena nukleaza, ki dokonča razgradnjo mitohondrijske RNA. Ta nukleaza še ni odkrita, predpostavlja pa se, da ni povezana z mtEXO.

Eksoribonukleazna aktivnost Dss1p je koordinirana in odvisna od aktivnosti RNA helikaze, proteina SUV3p. Sam je pomemben tako za prepoznavo substrata kot tudi odvijanje RNA ter združevanje teh dveh podenot mtEXO v in vivo pogojih.

Pri nepravilnem delovanju katerekoli od omenjenih podenot mtEXO je rezultat prenehanje mitohondrijske translacije, kopičenje RNA z abnormalnima 3 in 5 koncema in različne oblike navadne mirujoče mRNA. Iz tega sledi, da je glavna vloga mtEXO razgradnja RNA, obstaja pa tudi možnost da so v mitohondrijih kvasovk obračanje, nadzor in zorenje RNA na 3 in 5 koncu sklopljeni procesi.

Človeški in kvasovkini helikazni ortologi imajo več kot 50 sekvenčno podobnost. Kljub temu je pri človeku helikazna aktivnost 104-krat večja za dvoverižno DNA kot dvoverižno RNA. To nakazuje različno fiziološko funkcijo pri dveh vrstah, čeprav točne funkcije SUV3p pri človeku še ne poznamo. Ljudje pa v mitohondrijih nimamo Dss1p, kjer so namesto njega prisotne druge ribonukleaze. Odkrili so polinukleotid fosforilaze, ki jih pri kvasovkah ni. Točna vloga le-teh tudi še ni poznana, domneva pa se, da je predstavljajo nadomestek za Dss1p in imajo torej vlogo pri razgradnji mitohondrijske mRNA.

Poliadenilacija mitohondrijske mRNA

Pri ljudeh in kvasovkah se pri razgradnji vloga 3 konca mRNA razlikuje. Pri kvasovkah, za razliko od človeka, poliadenilacija ne poteka niti pri razgradnji mitohondrijskih RNA. Zrela mitohondrijska mRNA vsebuje pri njih 12-člensko nukleotidno zaporedje, ki ga kodira mitohondrijska DNA v svoji 3 neprevedeni regiji. Ta zaporedja so ključnega pomena pri stabilizaciji in translaciji mRNA. Domneva se, da je pri procesu vključen tudi določen protein, a njegova funkcija in genski zapis še nista znana.

Pri človeku je drugače. Mitohondrijski genom se popolnoma prepiše z obeh verig dupleksa, rezultat pa so policistronske RNA, na katere delujejo endonukleaze, ki jih razcepijo. Nekaj mitohondrijske mRNA nima funkcionalnega STOP kodona pač pa se konča z U ali UA koncem. Nato poteče 3 poliadenilacija.

Za poliadenilacijo so verjetno odgovorni encimi polinukleotid fosforilaze. Domnevani sta dve vlogi teh encimov, in sicer razgradnja RNA in sinteza 3 konca, ki ne potrebuje matrice. Čeprav prednostno vežejo adeninske nukleotide, so nastali podaljški lahko heteropolimeri. Pri človeku so ti podaljški večinoma poli-A, redko najdemo vmes tudi druge nukleozide.

Naloga poliadenilacije je tvorba funkcionalnega STOP kodona, ki ga ni v določenih človeških mitohondrijskih molekulah mRNA po zorenju policistronskih podenot. Obenem pa ima ta poli-A konec tudi vlogo pri stabilizaciji mitohondrijske mRNA, saj so ugotovili, da je mitohondrijska mRNA manj stabilna v primeru, da so poli-A zaporedja krajša.

Tako prisotnost kot tudi vloga poliadenilacije sta pri različnih vrstah organizmov različna. Med evolucijo se v različnih genetskih sistemih različnih organizmov niso ohranili enaki mehanizmi nadzora stabilnosti mitohondrijske mRNA, pač pa je pri vsakem favoriziran drugi.

mRNA nadzorni sistemi v mitohondrijih

V citosolu in jedru obstajata dva kompleksna sistema za nadzor kvalitete mRNA. Prvi sistem išče mRNA s STOP zaporedjem na napačnem mestu (nesmiselno pogojena razgradnja mRNA). Posledica te napake je nepopolna translacija mRNA. Drugi prepozna mRNA brez STOP kodona na 3 koncu mRNA. Ali se v človeških mitohondrijih pojavlja, kateri od teh sistemov Translacija mRNA, ki nima STOP kodona vodi v hitro potranslacijsko razgradnjo na osnovi deadenilacije. Po drugi strani pa se nesmiselne mRNA ne razgradijo nič hitreje kot le-tem odgovarjajoče nemutirane mRNA.

Pomembna vloga kvasovkinega mtEXO-a oz. degradosoma v kvasovkah je bila dokazana z mutacijami na genih za podenote. S tem so dokazali tudi, da degradosom ne vpliva direktno na zorenje obeh nekodirajočih koncev, saj so se kljub mutacijam tvorile tudi pravilne mRNA.

Še vedno se pojavlja vprašanje, kako sistemi nadzora v kvasovkah razločijo med nepravilno in pravilno mRNA. Ve se, da se na 5 neprevedljivi konec vežejo proteini, ki mRNA stabilizirajo in aktivirajo translacijo. Prav tako se na 3 koncu nahaja 12-člensko nukleotidno zaporedje, ki ga prepoznajo nadzorni proteini in se nanj vežejo. Verjetno imajo interakcije med temi proteini in degradosomom zelo pomembno vlogo v nadzoru stabilnosti mitohondrijske mRNA.

Na osnovi poskusov se je izoblikovala tudi hipoteza, da sta nadzor in procesiranje kot v citoplazmi sklopljena.

Zaključki in prihodnost

Poliadenilacija ima zelo paradoksalne vloge v nadzoru stabilnosti mRNA med različnimi vrstami. Vsi evkarionti imajo poli-A repe (kvasovke 70-90 in sesalci 200-300 bp dolge), ki stabilizirajo jedrne mRNA. Po drugi strani pa poli-A repi v prokariontih in kloroplastih (v jedrih in mitohondrijih) pospešujejo razgradnjo mRNA. Pri mitohondrijskih mRNA nekaterih organizmov imajo poli-A repi podobno vlogo kot pri jedrni mRNA. Ti repi so dolgi od 50-60 bp.

Stabilizacijski efekt poli-A repa jedrnih mRNA je posledica vezave poli-A vezavnih proteinov - PABPs na repe in s tem večje stabilnosti, ki lahko da je proporcionalna z dolžino repa, saj daljša ko je, več proteinov se lahko veže. Ko je rep enkrat prekratek se protein ne more več vezati, čemur sledi razgradnja. Repi vplivajo na 3 → 5 in 5 → 3 poti razgradnje.

Obstoj teh proteinov v kloroplastih rastlin je nedokazan, po čemer se lahko sklepa na vlogo poli-A repa v rastlinah - razgradnja.

Pri kvasovkah je vlogo poli-A repa nadomestilo specifično zaporedje dolgo 12 nukleotidov, ki dajejo degradosomu proteinskemu kompleksu odgovornemu za razgradnjo pri kvasovkah signal, da je mRNA primerna za prepisovanje. V poti tega signala so pomembni že prej omenjeni nadzorni proteini.

Celostno podobo in razumevanje cikla obstoja mRNA je še potrebno doseči. Tudi zato, ker so razlike med posameznimi vrstami velike in nam poznavanje mehanizmov pri kvasovki ne pomaga v tolikšni meri kot bi nam lahko.