NO



Zamislite si leto 1985. Pijete kavico v prijetnem baru in umirjajočem vzdušju, ki ga zmoti prijateljeva pripomba o prenasičenosti zraka z NO, zaradi vse večjega prometa. Prijatelja opozorite, da ni samo promet glavni proizvajalcec dušikovega oksida, ampak ga tvorijo tudi kobilice, hrošči, miši, podgane, mehkužci in nazadnje tudi ljudje.

Udeležba pri mnogih procesih., ki so nujni za obstoj živlenja je tista, ki daje NO tako pomembno vlogo v biološkem sistemu. NO regulira:

1. translacijo mRNA pri kontroli Fe metabolzima
2. mutagenezo
3. apoptozo
4. glikoliza pri e- transportu v mitohondriju
5. acilacija proteinov
6. sinteza deoksinukleotidov
7. fusija mioblastov
8. adhezija trombocitov in nevtrofilcev
9. proliferacija mieloidnih progenitornih celic, T cells, keratinocitov, tumorskih celic
10. sporstitev hipofiznih hormonov
11. tonus bronhusov in sfinkterjev
12. kontrakcija želodca, gladkega črevesa, uterusa, srca
13. erekcija penisa
14. odvisnosti od opiatov
15. toleranca
16. spomini
17. spanje
18. porjavenje
19. krvni pritisk

Poudariti pa je treba tudi to, da je NO prijatelj in sovražnik hkrati.

Za tako enostabvno molekulo kot je NO je potreben veliko bolj zapleteno zgrajen encim, ki sodeluje pri sintezi NO - imenujemo ga NOS.


ENCIM NOS

Encimi NOS so homodimeri, ki so sestavljeni iz monomerov. To sta pravzaprav dva encima, ki sta združena: citokrom reduktaza in citokrom. Oba potrebujeta tri kosubstrate (O2, NADPH, L-arginin) in pa 5 kofaktorjev (FAD, FMN, KALMODULIN, TETRAHIDROBIOPTERIN (BH4) in pa HEM).

Poznamo dve obliki NOS, ki ju kodirajo različni geni:

· KONSTITUTIVNA OBLIKA NOS (cNOS)
cNOS potrebuje za svojo aktivnost kalmodulin in Ca2+.
cNOS delimo še na: -ncNOS - encim, ki je bil prvič izoliran iz nevronov in ga najdemo v citosolu ali pa vezanega na cel. membrano. Mr=150-160 kDa;
- in na ecNOS - encim izoliran iz endotelijskih celic.
cNOS je vedno prisoten v sesalskih celicah in odtod tudi njegovo ime.

· INDUCIBILNA OBLIKA NOS (iNOS)
Za svojo aktivnost sicer portebuje kalmodulin, katerega vezava pa ni odvisna od koncentracije Ca2+. Mr=130 kDa in je v citosolu v obliki dimerov. Prvič so jo izolirali iz makrofagov.

Druga možna delitev, pa je glede na dolžino aktivnosti posamezne oblike v fizioloških pogojih:
1. cNOS je aktiven manj časa, ker je njegova aktivnost vezana na Ca2+. Zato je vključen v tisto reakcijsko pot, kjer je malo produktov - prevajanje živčnih impulzov
2. iNOS ima daljšo aktivnost, njegova reakcijska pot pa ima mnogo produktov.


REGULACIJA NOS

1. RAZVOJNA
Samo izražanje NOS v šele razvijajočem se osebku se razlikujejo od izražanja pri odraslem organizmu.

2. KONTROLA TRANSKRIPCIJE
Različni faktorji vplivajo na PROMOTORSKO REGIJO na DNA, ki kodira zapis za NOS. Ti faktorji pa so lahko ali vzpodbujevalni ali pa delujejo na samo transkripcijo inhibitorno.
V prvi skupini poznamo INTERFERON g in LPS (lipopolisaharidi). Predvsem interferon g je eden najpomembnejših dejavnikov pri sintezi NO, ker:
a) inducira sintezo oz. sam encim NOS
b) inducira tudi GTP hidrolazo, ki sodeluje pri izdelavi kofaktorja BH4
c) indukcija encima argininosukcinatna sintetaza, ki izdeluje substrat L-arginin, ki je potreben za nastanek NO.

Inhibbitrji transkripcije: TRANSFORMIRAJOČI RASNI FAKTOR b (TGFb) - pri žilni in gladki mišičnini; in Fe3+ pri makrofagih.

3. POSTRANSLACIJSKA KONTROLA
Za regulacijo je bistvena stabilnost mRNA. Primer: TGFb destabilizira mRNA, ki kodira iNOS, cikloheksamid pa stabilizira to isto mRNA. Se pravi gre za faktorje, ki stabilizirajo ali destabilizirajo mRNA.
Imamo pa tudi faktorje, ki zmanjšujejo količino mRNA in s tem količino produkta.

4.POSTRANSLACIJSKA KONTROLA
Na tem nivoju se regulira predvsem ravnotežje med aktivno in inaktivno obliko NOS.
Možna je miristoizacija: miristoil (izopropil s 14 C) usmeri NOS, tako da se ta veže na membrano ali pa fosforilacija, ki usmeri NOS v citosol.
Transkripcija NOS vodi do formacije NEREAKTIVNIH MONOMEROV. Za aktivacijo je potrebna konformacijska sprememba na N-koncu, za kar je potrebna vezava L-arginina, BH4 in hema. S tem je omogočena dimerizacija.
Pri iNOS je dimer takoj aktiven, pri cNOS pa ne, ker se mora nanj vezati KALMODULIN, na katerega se prej veže Ca2+, ki je obvezen za vezavo na kompleks.
Tudi pri cNOS je sicer potreben kalmodulin, katerega vezava pa ni odvisna od koncenracije Ca2+. Glavni regulator za aktivnost cNOS je torej konc. Ca2+ za iNOS pa količina njegove mRNA.


FUNKCIJA NO

Vsaka sesalska celica je na tak ali drugačen način podvržena vplivu NO, ki je lahko bodisi ugoden, kar pomeni da celico ščiti, bodisi škodljiv se pravi toksičen. Obstajajo štirje glavni funkcijski sklopi delovanja NO:
1. prenos živčnih signalov
2. zaščita žilnega sistema
3. imunski odziv
4. ostalo

Prenos živčnih signalov

NO se v živčevju po potrebi sintetizira v pravih živčnih celicah- nevronih in se tam ne kopiči. Do tarčnih celic se NO prenaša s pomočjo difuzije, intracelularno pa difundira do tarčnih struktur ali organelov. Na ta način ne deluje preko receptorjev v plazemski membrani in tako ima NO v živčevju deloma vlogo nevrotransmitorja deloma vlogo hormona. Ločimo pa še naslednje poglavitne vloge NO:
· nonadrenergično-noncholinergično (NANC) prevajanje živčnih signalov v perifernih kontraktilnih in sekretornih tkivih; NO je posrednik pri zmanjšanju intracelularne koncentracije CA2+, inhibiciji mišične krčljivosti, bronhodilatorni inervaciji, rasti itd.
· sinaptogeneza; NO pomaga pri vzpostavljanju sinaps
· sinaptična aktivnost; če je stimulacija s strani presinaptičnega nevrona nezadostna, se iz postsinaptičnega nevrona sprošča NO, ki presinaptični nevron obvesti, da je treba koncenrtacijo nevrotransmitorja povečati.
· spomin; NO sodeluje v dolgotrajnih spremembah celične funkcije in s tem morda sodeluje v spominskem mehanizmu
· obdelava podatkov, sprejetih s čutili; NO sodeluje v slušni in vidni poti, morda tudi pri zaznavanju bolečine
· patofiziološki učinki; NO vpliva na pojav migrene, epilepsije, kapi in drugih nevrodegenerativnih bolezni
· ostalo; No verjetno vpliva na budnost, hranjenje in pitje

Zaščita žilnega sistema

NO, iz endotelijskih celic deluje kot EDRF (endothelium-derived relaxing factor), ki ima več funkcij, vse pa služijo zaščiti žilnega sistema:
· inhibicija aktivacije trombocitov
· inhibicija degranulacije celic kostnega mozga
· inhibicija diapedeze nevtrofilcev
· inhibicija kontrakcije gladkih mišičnih celic v steni žil
· inhibicija zleplanja levkocitov
· inhibicija endotelijske permeabilnosti
· inhibicija prolifercije in migracije gladkih mišičnih celic in celic tunicae intimae stene žil

Imunski odziv

NO ima pomembno vlogo tudi pri imunskem odzivu. Medtem ko je večina obveščevalnih funkcij NO odvisna od specifičnega izražanja cNOS, so skoraj vse celice sposobne izražati od Ca neodvisno NOS (iNOS).Tako se celica lahko vključi v imunski odziv, ki je v primeru uporabe NO nespecifičen, za razliko od delovanja protiteles. Sinteza NO se zato med vnetjem poveča, kar pa lahko ob preveliki sintezi vodi do negativnih posledic. Te so med drugim: glomerulonefritis, uničenje b celic pankreasa pri diabetesu, zavrnitev presajenih organov, oslovski kašelj in ostale avtoimunske bolezni.

Ostalo

NO je tudi vključen v avtokrino in parakrino regulacijo izločanja polipeptidov, nevrotransmiterjev in ionov. S tem v zvezi ima več funkcij kot npr.:
· znižuje koncentracijo glukoze, ki je potrebna da se izloči insulin
· inhibira sintezo adenokortikoidov in se tako vključuje v kontrolo intenzitete imunskega odziva
· vzpodbuja izločanje luteinizirajočega hormona (LH), regulira gibljivost spermijev, vpliva na erekcijo, na fetalni krvni obtok, na plodovo prehrano in rast, ob prvih porodnih popadtkih pa koncenracija NO pade in s tem je mogoč porod.


NO je dvorezen meč:
a.) koristen kot obveščevalec ali modulator in pri imunološki obrambi
b.) škodljiv - potencialno je strupen.

NOS



NOS je kompleksen encim, ki vsebuje več tesno povezanih redoks kofaktorjev , ki so organizirani v posamezne domene, ki jih lahko povežemo z različnimi aktivnostmi.

Potek reakcije:


O2 O2

Potrebe reakcije so molekularni kisik (O2) in reducirajoči ekvivalent v obliki NADPH. NOS uporablja kot substrat L-arginin, produkta reakcije pa sta NO in citrulin. Po raznih študijah (homologija z NADPH citokrom P-450 reduktazo, P-450 tip hem) so pokazali, da NOS verjetno posreduje reducirajoči ekvivalent k citokromu P-450.


Podobnost z citokromom P-450

Pri raziskavah se je pokazalo, da ima NOS po redukciji in obdelavi z monoksidom maksimum absorbcije pri 450 nm. To pa je značilnost velike družine citokrom P-450 encimov. Njihova poglavitna funkcija pa je oksidativni metabolizem - hidroksilacija. Razlika je v tem, da večina P-450 potrebuje flavoprotein reduktazo in včasih železo sulfur protein za transport elektronov v hem, ki je odgovoren za oksidativno katalizo. NOS pa je prvi self-sufficient protein, kar pomeni da ima reduktazo in hem vključena v enem samem polipeptidu. So pa še druge razlike:

· P-450 imajo 10 AK, ki vsebujejo cistein, česar NOS nima
· substrati P-450 so zelo hidrofobne molekule, substrat NOS (L-arginin) pa je hidrofilna. NOS izooblike morajo vsebovati primerne ostanke za akomodacijo tega substrata in tudi drugih intermediatov, ki nastanejo tekom reakcije.
· razlike na N-koncu domene kjer je lociran hem

Zaradi teh nehomolognosti lahko NOS prištevamo med klorperoksidaze, allene oksid sintaze in tromboksan sintaze. To so proteini, ki imajo enake optične lastnosti kot P-450, drugače pa so le daljni sorodniki P-450.


Mehanizem reakcije








slika 1
Kot kaže slika 1 NOS katalizira hidroksilacijo L-arginina v Ng-hidroksi-L-arginin (NHA). Ta del reakcije verjetno poteka na hemu. Glavni intermediat reakcije je železov peroksid kot nukleofil (Fe(III)-OO-). NOS reducira oksi-hem kompleks (Fe(II)-O2)v Fe(III)-OO-, ki tvori spojino na substratu, ta pa postane odvečen elektronski radikal na NO.


NOS izooblike

Razlikujemo dve skupini:
Ţ konstitutivna izooblika; Ca2+/CaM odvisen tip, ki je vključen v celično signalizacijo. cNOS so izolirali iz podgan in prašičjih možgan in je v citosolu ter v naravnih pogojih v obliki homodimer. (Mr=150-160 kDa).
Ţ inducibilna izooblika v makrofagih in drugih celicah, ki ne kaže odvisnosti od Ca2+/CaM. Izolirali so jo iz makrofagov in je citosolen protein z Mr=130 kDa, ter je v obliki dimerov pod naravnimi pogoji.
Ţ
Izooblike iz istega tkiva so si zelo podobne: primerjava sekvence AK človeške in volovkse kaže 95 \% ujemanje, obedve pa kažeta 50-60 \% podobnost z inducibilno obliko.


Ca2+/CaM odvisnost

Aktivnost cNOS je strogo kontrolirana z Ca2+ in CaM in predvsem je tu kritična točka regulacija intracelularnega Ca2+. Konstitutivna oblika kaže tipično interakcijo med kalmodulinom, pri čemer je kompleks CaM-NOS reguliran z koncentracijo Ca2+. Ta Ca2+/CaM vezava je pomembna za prenos elektronov. cNOS sočasno z Ca2+/CaM-NOS kompleksom in v odsotnosti substrata (L-arginin) reducira O2 in proizvaja O2- in vodikov peroksid (H2O2), medtem ko bi iNOS pri neki osnovni stopnji produciral O2- in H2O2, ki pa bi narasla in se tudi podvojila v prisotnosti substrata.



REDOKS SIGNALIZACIJA:


NO deluje na dva načina:
· preko protein kinaz, ki kontrolirajo funkcije preko kovalentnih modifikacij (fosforilacija)
· in preko reaktivnih kisikovih spojin (reactive oxygen species, ROS), ki pa signalizirajo preko redoks primerov in s koordinativnimi interakcijami s kovinami.

V mnogih primerih pa NO tarče funkcionirajo bodisi v molekularnem prepoznavanju NO, bodisi v preklopnem mehanizmu, ki prevede kemični signal v funkcionalni odziv.

NO v bioloških sistemih reagira s kisikom (O2), superoksidom (O2-) in prehodnimi kovinami (M) (slika 2). Vsak od produktov teh reakcij, NOx, peroksinitrit (OONO-) in M-NO, je zmožen reagirati dalje z nukleofilnimi centri. Ker se med temi najpogostejši tioli, prevladuje tvorba S-nitrozotiol-a (RS-NO).









slika 2

Glavne tarče NO pa so proteini, ki vsebujejo tiole in kovine bodisi na alosteričnih ali aktivnih mestih: signalni proteini, ionski kanalčki, receptorji, encimi in transkripcijski faktorji.


Interakcije NO s kovinami

Koordinativne kovalentne interakcije majhnih difuznih ligandov z FeS skupinami in hem proteini, lahko vodijo bodisi k padanju ali zvišanju proteinske aktivnosti. Inaktivacija FeS proteinov v bioloških sistemih je povezana z reaktivnostjo NO, O2- in OONO- z drugimi substrati (encim elektronske prenašalne verige v mitohondriju - inaktivacija).
Druga možnost pa je regulacija na nivoju pretvarjanja kovinskih signalov v gensko izražanje. NO lahko s sproščanjem kovine iz NO-kovina kompleksa povzroči vezavo te kovine na akonitazo, ta pa se nato poveže z IRE (iron responce elenment), majhen nepreveden del mRNA, ki kodira protein (fertin, transferin), kar povzroči padanje ali naraščanje proizvodnje proteina. NO tako regulira Fe homeostazo.
NO je zmožen inhibirati hem vsebujeoče encime, če ti pri katalizi uporablajo prostetično skupino. Vezava NO na Fe2+ ali Fe3+ hema povzroči zmanjšano aktivnost encima (oxigenaza). NO pa deluje še na druge hemoproteine: citokrom P-450 encimi, mioglobin, hemoglobin, katalaza, peroksidaza, citokrom C.


Interakcije s tioli

Reakcija med tioli (tiolati, RS-) in NO poteka tako, da se mora NO najprej oksidirati v NO+ in šele nato se lahko poveže z tiolom.
S-nitrozilacija (prenos NO+ skupine na tiol, ki se nahaja na aktivnem mestu) lahko regulira funkcijo proteinov na več načinov:
· Aktivacija tkivnega plazminogena nastane iz postranslacijske modifikacije v domeni rastnega faktorja, ki je odmaknjena od aktivnega mesta - konformacijska sprememba.
· NO spremeni intramolekularne H vezi ali elektrostatične reakcije, s tem pa doseže strukturne spremembe, ki povzročijo interakcije med encimom in substratom (oslovski kašelj, GDP).
· tvorba SS mostičkov pri čemer se s pomočjo RS-NO pospeši tvorba disulfidne formacije, ker postane pozitivno nabito žveplo bolj dovzetno za napad sosednjega tiola RS-. Važno je to, da lahko NO skupina prevzame negativen naboj in tako pospeši konforamcijski preklop. (ionski kanalčki, nevrotransmicija, protein kinaza C).
· Zadnja možnost pa je da NO skupina povzroči večjo kislost tiola in s tem omogoči tiolatni napad in nadomestitev elektrofilne metilne skupine iz DNA (CERB - cAMP response element-bining protein)
S-nitrozilacija pa lahko s svojim delovanjem inhibira aktivnost tistih encimov, ki imajo na svojih aktivnih mestih AK cistein. Takšni encimi so: kathepsin B, aldolaza, g-glutamilcisteinil sintetaza, O6-metilguanin-DNA metiltransferaza, alkohol in aldehid dehidrogenaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH). Potencialni mehanizem te inhibicije je ADP-ribosilacija, kar pomeni modifikacija regulatornega proteina, pri čemer je delež NAD - ADP-riboza prenešen na konec cisteina z odcepitvijo nikotinamida (GADPH, aktin, serumski albumin)


Toksičnost

Toksičnost NO je odvisna od kemijskih procesov v danem biološkem okolju. Reakcije NO z tarčami ROS so lahko škodljive ali zaščitne, odvisno od narave poškodbe.V sistemih kjer toksičnost povzroči predvsem ROS, NO prekinja verižne reakcije in s tem omejuje škodo. V sistemih, kjer pa toksičnost izvira iz NO biosinteze, pa so reakcije z ROS lahko škodljive, pri katerih s povečanjem ranljivosti do nitracijskih reakcij, pride do spraznitve energetskih zalog, in do oksidacijskih reakcij, ki pa zmotijo celične funkcije.
Citotoksičnost je omejena proti vdorom mikroorganizmov, tumorskim celicam ali pa proti nepričakovanim škodljivim nevronom. Celice se branijo pred prekomerno NO produkcijo in s tem pred oksidativnim stresom na ta način, da vsebujejo regulatorne gene, ki nosijo rezistenco proti oksidantom. Ekspresija le teh pa je kontrolirana s proteini, ki vsebujejo bodisi tiole bodisi kovine. Tak primer je redox-sensitive superoxide response regulon (SoxRS) - multigen sistem, ki nosi rezistenco bakterij za O2- in NO. Mehanizem, ki prevede NO/O2- signal v gensko ekspresijo, je po vsej verjetnosti reguliran z FeS skupino. Zvišana koncentracija NO in O2- povzroči transkripcijo rezistenčnih genov kot sta manganova superoksid dismutaza (SOD) in glukoza-6-fosfatna dehidrogenaza (G6PD). S tema dvema in še z glutation S-transferazo se celice branijo pred zvišano konc. NO. Indukcija SOD in G6PD je fiziološki odziv proti citokinezi, ki inducira visoko proizvodnjo NO sinteze in tudi transkripcijska kontrola glutation S-transferaze je vodena z AP-1 transkripcijskim faktorjem, ki je pod kontrolo NO. Ta celična aktivnost pripravi celice na nenaden dvig koncentracije NO, kar povzroči smrt vseh tistih invazijskih nepripravljenih celic.


Signalizacija

NO v telesu prosto difundira iz endotelija k vaskularnim gladkim mišicam in preko neuronskih sinaps ter povzroča biološki odziv. NO aktivira G proteine, ionske kanalčke in vpliva na redoks občutljive kinaze in je na ta način v zvezi s signalizacijskimi potmi v ali na plazemski membrani, s tem pa je vključen v tradicionalne signalizacijske vzorce.