NOMENKLATURA

Proteini so dobili svoje ime zaradi značilnih spektralnih lastnosti in ne npr. zaradi katalitičnega delovanja. Ime P450 je tako sestavljeno iz P kot pigment z vrhom absorpcijskega spektra pri približno 450 nm.
Naprej jih delimo na poddružine in družine, ki temeljijo na podobnostih v aminokislinskem zaporedju na genih. Pripadniki iste družine so si podobni v 40 aminokislinskega zaporedja, člani iste poddružine pa vsaj v 55.

Primer: CYP1A2
CY - cytochrome
P - P450
1 - družina
A - poddružina
2 - specifičen citokrom


RAZVOJ

Citokromi so se razvijali predvsem zaradi selektivnega pritiska okolja, npr. prehranjevalnih navad. Prvotni geni so omogočili nastanek citokromov,ki metabolizirajo endogene substrate. Prvi citokromi so tako metabolozirali holesterol in maščobne kisline. Očitno je torej, da so imeli citokromi vlogo pri vzdrževanju integritete membrane v zgodnjih evkariontih.
Do sredine 90-ih let je bilo poznano nukleotidno zaporedje za več kot 300 genov CYP450. Veliko pa jih je še danes neodkritih. Ena od metod ugotavljanja zaporedja in s tem identificiranja posameznih CYP450 temelji na specifičnih substratih. Metoda pa je zelo zapletena in nedovršena.

Zapisi za ciokrome variirajo med posamezniki,kar lahko včasih prinaša tudi negativne posledice. Posamezniki so lahko nezmožni presnove zdravil na dovlj učinkoviti ravni. Imenijemo jih ‘poor metabolizers’.



SPLOŠNA REAKCIJA, KI JO KATALIZIRA CYP (citokrom P450)

NADPH + H+ + O2 +SH → NADP+ +H2O +SOH

S (SUBSTRAT): steroid, zdravilo, maščobna kislina ali katerakoli druga kemična spojina, ki ima alkan, alken, aromatičen ali heterocikličen obroč, na katerem lahko pride do oksigenacije.

Reakcija se imenuje monooksigenacija, encim pa monooksigenaza, saj se samo en kisik združi s substratom.

V sesalskih celicah služijo citokromi kot končni receptorji za elektrone v »transportnih sistemih elektronov«, ki so prisotni ali v ER ali v notranji membrani mitohondrijev.
V citokromu P450 je enojna železova skupina, ki veže kisik. Nastane hemoprotein, ki vsebuje vezavna mesta za substrat.
Da hidroksilacija (monooksigenacija) poteče, se mora železov ion reducirati iz Fe3+ na Fe2+. Ko se citokrom poveže s substratom se spremeni konfiguracija in redoks potencial se zniža za približno 100mV, kar pospeši oddajanje elektronov NADPH na citokromu. Redukcija citokromov P450 z elektroni NADPH poteka preko encima NADPH-cyp P450 reduktaze.
Za celotno monooksigenacijo sta potrebna 2 elektrona:
• prvi za redukcijo železa (Fe3+Fe2+), kar omogoči vezavo kisika
• drugi pomaga pri odcepitvi kisika, ki se kasneje veže na substrat


INDUKCIJA

Indukcija je proces zvišanega izražanja gena, kar kot posledico pomeni zvišanje koncentracije genskih produktov pod določenimi pogoji v celici.
Tako lahko inukcija citokroma P450 spremeni učinke zdravil. Zdravila se lahko posledično inaktivirajo ali pa se hitreje izločajo iz telesa. Pride pa lahko tudi do stranskih učinkov, zaradi povečane tvorbe toksičnih metabolitov, kar pa lahko povzroči poškodbe na celici.
PRIMER:
• Povečano izločanje oralnih kontraceptivov je posledica nekega protituberkoloznega zdravila. To zdravilo je namreč inducent CYP3A4. Posledica je zvišanje rizika za nosečnost žensk, ki jemljejo oboje.
• Zgodili so se tudi smrtni primeri pacientov, ki so hkrati jemali nek sedativ (in hkrati inducent citokroma P450) in antikoagulant. Za ohranitev učinkovitosti antikoagulanta tako je potrebna večja koncentracija, saj je hkrati tudi substrat za citokrom P450. Po odstranitvi sedativa (induktorja) iz terapije je treba prilagoditi tudi koncentracijo koagulanta, da ne bi prišlo do nepotrebnih krvavitev.
• Tudi indukcija citokroma CYP2E1 zaradi alkohola (alkoholizma) lahko povzroči poškodbo jeter v kombinaciji z običajnim analgetikom.

POLIMORFIZEM

Citokromi P450 se med seboj razlikujejo tudi v hitrosti presnove določenega zdravila zaradi njihove različne genetske zasnove. V dani populaciji lahko obstajajo različne oblike gena za citokrom P450, kar spremeni funkcionalno aktivnost citokroma P450. Pojav imenujemo genetski polimorfizem. Posameznik zaradi tega npr. ne more dovolj zadostno presnavljati določenega zdravila; v telesu zato ostane znatno višja raven tega zdravila. Zaradi prevelike doze zdravila in pod pogojem, da je preostala oblika zdravila farmakološko aktivna, lahko pride do zastrupitve.
PRIMER:
Pri različnih populacijah so odkrili prevelik učinek v primeru zdravil proti visokemu pritisku in tudi neučinkovitost kodeina kot pomirjevala, saj se ne spreminja v morfij kot je običajno.

INHIBITORJI CITOKROMOV P450

Inhibicija se uporablja za prepoznavanje metabolne vloge citokromov P450 v organih, v katerih delujejo. S pomočjo inhibitorjev je bilo dokazano, da so CYP450 lahko udeleženi v poteh metabolizma. Močan inhibitor je tako CO, ki se veže na železo z večjo afiniteto od kisika. Spremeni se absorbcijski spekter, ugotovimo lahko prisotnost citokroma, ne pa določene vrste. Ta vrsta inhibicije je tako nespecifična in karakteristična za večino citokromov P450, ne razlikuje pa med posameznimi oblikami.
Za natančnejše določanje vrste CYP450 je uporabna metoda s tako imenovanimi ‘suicide substrates’, ki so zelo podobni pravim substratom (in so zato postali specifični za določen citokrom P450). Vežejo se na prostetično skupino in tvorijo nepovraten produkt, ki zavre delovanje citokroma. To lahko postane način za izdelavo zdravil.


PRENOS ELEKTRONOV

Za prenos elektronov z NADPH na CYP450 je potreben posrednik, saj NADPH odda po 2 elektrona, medtem ko CYP450 lahko sprejme le po enega naenkrat. Zato mora biti protein, ki prenaša elektrone od NADPH do citokroma P450, sposoben sprejeti dva elektrona hkrati in ju oddati vsakega posebej. Posrednik je flavoproteinska reduktaza. Prenos elektronov poteka izključno v dveh sistemih: v mitohondriju in endoplazmatskemu retikulumu.
Endoplazmatski retikulum:
NAPDH odda dva elektrona flavoproteinu imenovanemu NADPH-citokrom P450reduktaza, ki je sestavljena iz 2 delov – FAD in FMN. FAD (flavin adenin dinukleotid) je vstopna točka za elektrona iz NADPH. FMN (flavin mononukleotid) pa je izhodna točka, ki elektron prenese na citokrom P450. Prvi elektron se vedno prenese direktno na citokrom P450, drugi pa se shrani in nato odda.
Notranja membrana mitohondrija:
V mitohondriju je na membrano šibko vezan protein NADPH-adrenodoksin reduktaza. Vsebuje samo FAD. Protein elektrona sprejme, vendar pa ju ne more direktno prenesti na citokrom P450. Elektroni se prenašajo preko majhnih proteinov adrenodoksinov. Ti imajo po dve domeni z žveplom in železom. Vsaka prevzame po en electron. Nato ju postopoma predata mitohondrialnemu citokromu P450.

FIZIOLOŠKE FUNKCIJE CYP450

Citokromi P450 metabolizirajo različne lipofilne komponente endogenega in eksogenega izvora. Ti encimi tako lahko katalizirajo
• enostavne hidroksilacije C-atoma metilne skupine
• insercijo OH-skupine na metilni C-atom na alkanu
• hidroksilacijo, ki pretvori aromatski obroč v fenol
• adicijo kisikovega atoma na mesto dvojne vezi
• oksidacije N, S, P-atomov
• dehalogenacijske reakcije

Sinteza steroidnih hormonov
Ene najpomembnajših reakcij, katalizirane s citokromom P450, so sinteze steroidnih hormonov iz holesterola v skorji nadledvične žleze in v spolnih organih. Tako mitohondrijski kot ER-sistemi, ki vsebujejo citokrom P450, morajo metabolizirati holesterol postopoma v aldosteron in kortizol (v nadledvični žlezi), testosteron (v testisih) in estradiol (v ovarijih).

Aldosteron (mineralokortikoid);
V mitohondrijih nadledvične žleze citokrom P450(CYP11A1) katalizira cepitev stranske verige holesterola. Iz holesterola tako nastane pregnenolon. Pregnenolon se nato iz mitohondrijev transportira v citosol, kjer se s pomočjo nekega encima oksidira v progesteron.Ta pa se metabolizira v 11-deoksikortikosteron, ki se nadalje hidroksilira v aldosteron.

holesterol  pregnenolon  progesteron 11-deoksikortikosteron  aldosteron

Kortizol (glukokortikoid)
Sinteza kortizola se nadaljuje iz pregnenolona ali progesterona. Katalizira jo CYP17, ki se nahaja v ER. Nastane 17--hidroksiprogesteron. Nato poteče hidroksilacija do 11-deoksikortikozola, ki jo katalizira CYP21. 11-deoksikortizol se transportira v mitohondrij, kjer poteče še hidroksilacija do kortizola.
Bolezni, ki so v zvezi z nezadostno produkcijo kortizola, pripisujemo prirojenim nadledvičnim hiperplazijam, to je čezmernim povečanjem nadledvične žleze zaradi prehitre rasti.

holesterol  pregnenolon/progesteron  17--hidroksiprogesteron  11-deoksikortikozola  kortizol

Testosteron
S pomočjo citokroma CYP17 lahko iz 17--hidroksiprogesterona nastane androstendion ali pa iz 17--hidroksipregnenolona DHEA. Dehidroepiandrosteron (DHEA se lahko metabolizira v androstenedion, ki služi kot neposreden prekurzor testosterona.
holesterol  pregnenolon/progesteron  17--hidroksiprogesteron  androstendion  testosteron
17--hidroksipregnenolon  DHEA androstenedion  testosteron
Estrogen
Sintetizirajo se iz androgenov . To imenujemo tudi aromatizacija, ker se v produkt vklaplja aromatični obroč.


Sinteza steroidnih hormonov med nosečnostjo
Sinteza steroidnih hormonov se med nosečnostjo močno poveča. Količina sintetiziranega estrogena med nosečnostjo močno presega količino proizvedeno pri ženski, ki ni noseča (okrog 1000-krat). Prve tedne nosečnosti je glavno mesto nastajanja estrogena corpus luteum v jajčniku. Pri približno 4. tednu nosečnosti pa estrogen in progesterone začne izločati tudi placenta. Placenta v 8. tednu postane glavni vir progesterona.
Zanimiva je razlika med steroidnim sistemom v placenti in jajčniku. Placenti namreč primankuje CYP11A1, zato placenta sama ne more sintetizirati estrogena iz holesterola. Placenta katalizira reakcijo za izgradnjo pregnenolona iz holesterola ter ga oksidira v progesteron, ki se sprošča v materin krvni obtok.
Kako potem placenta proizvaja estrogen, če ne more sintetizirati DHEA ali androstenediona iz progesterona To se doseže v zarodkovi nadledvični žlezi, ki predstavlja precejšen delež celotne zarodkove teže v primerjavi z odraslim človekom. Ta katalizira sintezo DHEA iz holesterola in ga izloči v zarodkov krvni obtok. Večji del zarodkovega DHEA se v njegovih ledvicah pretvori v 16--hidroksi-DHEA, ki se v placenti aromatizira v estrogen. Sodelovanje zarodkovega in materinega organskega sistema privede do proizvodnje estrogena med razvojem zarodka.

KSENOBIOTIKI

So eksogeni substrati, njihovo ime pa pomeni ‘tuji življenju’. To so zdravila, kemikalije , industrijski obstranski produkti, dodatki hrani. Citokromi P450 oksidirajo široko paleto ksenobiotikov, posebno hidrofobnih. Substratom uvaja hidroksilno skupino, jih naredi bolj polarne, to je topne v vodi. Nepolarni se namreč nabirajo v celici in jo tako ovirajo pri funkcijah. Zaradi citokromov P450 se ne nabirajo, naredi jih manj toksične in jih telo lažje izloči.
PRIMER:
Benzopiren nastane pri izgorevanju oglja, pečenju na žaru in kot obstranski ndustrijski produkt. Z vezavo na receptor inducira poddružino 1A citokromov P450. Benzopiren je že sam po sebi rahlo karcinogen, produkt, v katerega ga katalizira CYP450 pa je še bolj karcinogen. Kljub temu poškodba celice ni nujna; odvisna je tudi od drugih faktorjev - oklja, genetske zasnove, imunskega sistema.
Citokrom P450 doda oz. izpostavi funkcionalne skupine, tako naredi molekulo bolj polarno in prepoznavno za dodatne encimske sisteme, ki skrbijo za detoksifikacijo.

ZAKLJUČEK

Namen sistema citokromov P450 je dodati ali pa izpostaviti funkcionalne skupine, s čimer naredijo molekule bolj polarne in bolj dovzetne za napad dodatnih detoksifikacijskih encimskih sistemov. Mnoge te zmesi so podobne hormonom, ki so naši naravni komunikacijski signali in interferirajo s celica-celica ali organ-organ komunikacijo.
Citokromi P450 tako igrajo pomembno vlogo pri zdravju in bolezni ljudi. Različne oblike so odgovorne za tvorbo pomembnih steroidnih hormonov, regulacijo količine terapevtskih sredstev v krvi, odstranjevanje nezaželjenih kemikalij, ki bi se zaradi lipofilnosti kopičile, in tudi za tvorbo potencialnih strupenih metabolitov, ki bi povzročili celične poškodbe, poškodbe genetskega materiala ali tvorbo tumorjev.