Kaj so radikali

Splošni pojmi:
Antioksidant  je molekula, ki ščiti biološke tarče pred oksidativno škodo
Prosti radikal  vsaka kemijska spojina, ki vsebuje enega ali več prostih elektronov
Oksidativni stres  neravnovesje med nastajanjem reaktivnih kisikovih spojin in antioksidantov v korist prvim
Reaktivne kisikove spojine  skupno ime za kisikove radikale (O2˙ˉ, OH˙, peroxyl, alkoxyl) in nekatere neradikalne derivate kisika (H2O2)


Radikal je kakršna koli kemijska oblika (molekula, atom, ion, …), ki je sposobna samoobstoja in ima enega ali več neparnih elektronov. Najenostavnejši prosti radikal je atom vodika (H) z enim protonom in enim elektronom, ki kroži okoli njega.


Prosti radikali in drugi kisikovi derivati se neprekinjeno izdelujejo v telesu kot posledica metaboličnih procesov. Reaktivnost različnih prostih radikalov variira, nekateri lahko povzročijo nepopravljivo škodo na DNA, lipidih in proteinih.
Za zaščito pred takimi nezaželenimi posledicami imamo antioksidantni obrambni sistem, ki minimalizira škodo, ki bi jo lahko povzročili prosti radikali, vendar pa ni 100.


V pomoč sistemu antioksidantne obrambe imamo v telesu še druge mehanizme, ki se borijo proti prostim radikalom. To so popravljalni mehanizmi, ki popravljajo škodo, povzročeno od prostih radikalov.


ime formula komentar
vodikov atom H˙ najenostavnejši radikal
triklorometil CCl3˙ radikal, centriran na ogljikovem atomu (neparen elektron je na ogljiku); nastane pri metabolizmu CCl4 v jetrih
superoksid O2˙ˉ kisik-centriran radikal
hidroksil OH˙ kisik-centriran radikal, najreaktivnejši poznan radikal
tiil (thiyl) RS˙ žveplo-centriran radikal
peroksil, alkoksil RO2˙, RO˙ kisik-centriran radikal; nastane pri razgradnji organskih peroksidov
oksidi dušika NO˙, NO˙2 NO˙ nastane direktno iz AK l-arginina, NO2˙ pa, ko poteče reakcija med NO˙ in O2.
Tabela 1  Radikali

Lipidna peroksidacija
Peroksidacija poteče, ko kakršen koli prosti radikal (R˙) napade nenasičeno maščobno kislino (npr. v membrani). Čimbolj nenasičena je maščobna kislina, tem bolj je dovzetna za napade
prostih radikalov.
Radikal reagira z vodikom na koncu maščobne kisline. Sprosti se voda, nastane pa ogljik-centriran radikal na koncu maščobne kisline.
Ogljik-centriran radikal hitro reagira z O2. Posledica je nastanek peroksilnega radikala. Peroksilni radikal lahko napade druge maščobne kisline tako nadaljuje verigo reakcij, sam pa se pretvori v lipidno peroksidazo (—CO2H). Lipidna peroksidaza se začne nabirati v membrani, jo naredi nestabilno in prepustno za ione.
Peroksilni radikali pa ne napadajo samo membranskih lipidov, ampak tudi membranske proteine in tako poškodujejo encime, receptorje, signalni sistem, …

Shema 1  Lipidna peroksidacija


Superoksidni radikal

Superoksidni radikal (O2˙ˉ) je za en elektron reducirana molekula kisika. Je produkt fagocitov in pomaga pri ubijanju bakterij. Majhna količina superoksidnega radikala naj bi se tvorila tudi kot ekstracelularna signalna molekula. Poleg te namerne produkcije radikal nastaja še v mitohondrijih in zrnatem endoplazmatskem retikulumu kot neizogibna posledica metabolizma. Radikal nastaja zaradi »puščanja« elektronov, ki so zašli s svoje regularne poti v verigi.
Poleg naštetih poti pa superoksidni radikal nastaja še pri reakcijah med substrati telesnega izvora. Takšen substrat je adrenalin, ki počasi reagira z molekulo kisika, pri tem pa se sprosti radikal.


Vodikov peroksid – neradikal
Večino superoksidnega radikala (O2˙ˉ), nastalega v telesu, vstopa v reakcijo z vodikovimi protoni:
2O2˙ˉ + 2H+  H2O2 + O2

Vodikov peroksid ni radikal, je pa močno podoben vodi in zato zelo lahko prehaja membrane.
H2O2 ima določene metabolne funkcije. Tiroidna peroksidaza ga uporablja za izdelavo tiroidnih hormonov, njegovi produkti pa so inhibitorji transkripcijskih faktorjev in tako vplivajo na izražanje genov.


Hidroksilni radikal
OH˙ radikal je v telesu vedno škodljiv, drugi, manj reaktivni prosti radikali pa so lahko včasih tudi uporabni. Takšen radikal je NO˙ (dušikov monoksid). Nastaja pri razgradnji l-arginina v določenih vrstah celic. Je vazodilatator in verjetno tudi važen nevrotransmiter. Udeležen naj bi bil tudi pri obrambi pred paraziti.
Ko OH˙ nastaja v bližini DNA, napada tako deoksiribozo, kot tudi purinske in pirimidinske baze.



Vloga prehodnih kovinskih ionov
Superoksidni radikal in vodikov peroksid sama po sebi nista zelo reaktivna, v nizkih koncentracijah sta celo metabolno potrebna in uporabna. V kolikor pa prideta v stik z bakrovimi ali železovimi ioni, poteče reakcija:

O2˙ˉ + H2O2  OH˙ + OHˉ + O2

Po vsej verjetnosti lahko v organizmu poteče tudi reakcija:

ONOOˉ + H+  OH˙ + NO2˙

Če ta reakcija dejansko poteka v telesu, to pomeni, da lahko tudi brez prehodnih kovinskih ionov dobimo iz superoksidne kisikovega radikala hidroksilni radikal.


Radikali »v živo«
Radikali imajo različno reaktivnost, najbolj reaktiven je OH˙. Izpostavitev ionizacijskemu sevanju povzroči homolitsko cepitev O—H v telesni vodi.

H2O  H˙ + OH˙

Pri tem ne smemo pozabiti, da je človek iz več kot 70 vode. Če torej prejmemo visoko dozo sevanja, se koncentracija hidroksilnega radikala zelo poveča. Ta reagira s skoraj vsemi molekulami v človeškem telesu in jih poškoduje. Vendar pa ne more potovati. Zato deluje tam, kjer nastane.


Reakcije med radikali
Ob srečanju dveh radikalov poteče reakcija; neparna elektrona se združita v kovaletni vezi:

H˙ + H˙  H2 NO˙ + O2˙ˉ ONOOˉ

Vendar pa ob reakciji med neradikalom in radikalom vedno nastane nov radikal. Posledica je lahko verižna reakcija.
Ker je večina molekul v telesu neradikalskih, lahko že mala količina nekega radikala sproži močno verižno reakcijo (lipidna peroksidacija).



Antioksidantna obramba

Človek ima sisteme za odstranjevanje odvečnih količin superoksidnega radikala (O2˙ˉ) ter vodikovega peroksida (H2O2), nima pa sistema za odstranjevanje hidroksilnega radikala (OH˙).

Superoksidni dismutacijski encim (SOD – superoksidna dismutaza) odstranjuje superoksidni radikal tako, da pospešuje njegovo konverzijo v vodikov peroksid. Obstajata dve različici SOD encimov:
• MnSOD  encim z manganom v aktivnem centru; najdemo ga v mitohondrijih
• CuZnSOD  baker in cink v aktivnem centru; najdemo ga pretežno v citolosu

Katalaze so druga vrste antioksidantne zaščite. Najdemo jih v peroksisomih, kjer razgrajujejo vodikov peroksid (H2O2).
Najpomembnejši odstranjevalci H2O2 v celici pa so glutation peroksidaze (GSHPX). To so encimi, ki za svojo aktivnost potrebujejo selen (v seleno-cisteinskem ostanku) v svojem aktivnem centru. H2O2 odstranjujejo tako, da oksidirajo reducirano obliko glutationa (GSH) v oksidirano obliko (GSSG).
Glutationska reduktaza (FAD vsebujoči encim) reducira GSSG ponovno v GSH. Prejemnik elektronov v tem primeru je NADPH.

Reakcije glutationskega sistema:

2GSH + H2O2  GSSG + 2H2O

2GSH + MK-OH  GSSG + MK-H + H2O (MK = maščobna kislina)
(encim: glutation peroksidaza)

GSSG + NADPH + H+  2GSH + NADP+ (encim: glutation reduktaza)

Prav tako je zelo pomembno, da je celica oz. telo zgrajeno tako, da so kovinski ioni shranjeni tako, da jih je čim manj prostih in tako zmožnih tvoriti kisikove radikale.
Dodatno ima telo poleg antioksidativnih encimov še nekatere manjše molekule, ki pomagajo obrambi. To so t.i. odstranjevalci prostih radikalov.
Eden takšnih je prej omenjeni glutation (GSH), ki pa lahko sodeluje tudi pri encimskem odstranjevanju prostih radikalov (kot navedeno zgoraj).
Najpomembnejši takšne vrste odstranjevalec prostih radikalov pa je -Tocopherol (-TH). Najdemo ga v membranah in lipoproteinih. Deluje tako, da inhibira lipidno peroksidacijo, tako da lovi peroksilne radikale:

-TH + LOO˙  -T˙ + LOOH

-T˙ je prav tako radikal, ampak je manj reaktiven kot peroksilni, zato se verižna reakcija peroksidacije upočasni.
V telesu obstaja več načinov recikliranja -T˙ nazaj v -Tocopherol. Na površini membran in lipoproteinov se to zgodi z askorbatom:

-T˙ + askorbat  -TH + askorbat˙

ali z ubikinolom (reducirano obliko koencima Q):

CoQH2 + -T˙  TH + CoQH˙ +H+
Antioksidantna obramba v telesu je ključnega pomena za preživetje, kljub temu pa povišana količina antioksidantov lahko pomeni velik problem za telo.

Shema 2  Antioksidativni obrambni sistem encimov

Oksidativni stres in popravljalni sistem
Normalno je nastanek O2˙ˉ in H2O2 uravnotežen z antioksidantnim obrambnim sistemom, kar praktično pomeni, da antioksidanti niso prisotni v velikem presežku. Eden od razlogov za to je tudi uporabnost H2O2 in O2˙ˉ v živo, zato celice ne odstranijo oksidantov popolnoma (100).

V kolikor pa koncentracija antioksidantov pade, ali pa se produkcija H2O2 in O2˙ˉ poveča, se kot rezultat pojavi oksidativni stres. Nastane pa lahko zaradi:
 »izčrpanosti« antioksidantov  zaradi nezadostnega dotoka -Tocopherola, vitamina C, aminokislin vsebujočih žveplo (potrebne za nastanek GSH) ali riboflavina (za FAD kofaktor ter glutation reduktazo)
 povečane produkcije kisikovih spojin  zaradi izpostavljenosti višjim koncentracijam O2, zaradi prisotnosti toksinov, ki povzročajo nastanek prostih radikalov ali zaradi prevelike aktivnosti »naravnih« radikal-proizvajajočih sistemov (npr. nepravilna aktivacija fagocitotskih celic v kroničnih vnetnih procesih, …)


Celice lahko prenesejo blag oksidativni stres, katerega pogost rezultat se pokaže kot povečana sinteza antioksidantov. Rezultat izpostavljenosti povišanim koncentracijam O2˙ˉ je produkcija več kot 40 različnih proteinov.
Presežek O2˙ˉ ustvari presežek H2O2, kateri potem oksidira protein oxy R, kar vodi k aktivaciji transkripcije določenih genov, med drugim tudi genov za nastanek katalaze in glutation reduktaze.


Postopek z H2O2
Postopek z O2˙ˉ


Oksidacija oxy R proteina Nastanek H2O2 in aktivacija sistema Aktivacija soxR in soxS genov, kar vodi k povečani sintezi vsaj 9 proteinov, vključno z MnSOD in DNA popravljalnim encimom


Aktivacija transkripcije genov za povečano sintezo vsaj 8-ih proteinov, vključno z katalazo in glutation reduktazo
Tabela 2  Regulacija antioksidantov (E.coli)


Ker antioksidativna obramba ne odstrani vseh radikalov, ti konstantno povzročajo škodo na bioloških molekulah. Ta škoda se sproti popravlja, ampak določeno število molekul je kljub temu vedno okvarjenih.
Popravljalni mehanizmi

Substrat, ki se poškoduje Popravljalni sistem
DNA. OH˙ napada vse komponente DNA. Več drugih kisikovih reaktivnih spojin napada najraje guanin. H2O2 in O2˙ˉ ne napadata DNA. Širok spekter encimov prepozna neobičajnosti v DNA, jih izreže, resintetizira ter združi v DNA verigo

Proteini. Mnoge kisikove reaktivne spojine lahko oksidirajo –SH skupine. OH˙ napada aminokislinske ostanke. Proteini velikokrat vežejo prehodne kovinske ione, zaradi česar postanejo tarče napada OH˙ nastanka. Oksidirane metioninske ostanke lahko popravi metionin sulfoksid reduktaza. Druge okvarjene proteine lahko prepoznajo in razgradijo celične proteaze.

Lipidi. Nekatere kisikove reaktivne spojine (vključno z H2O2 in O2˙ˉ) lahko sprožijo lipidno peroksidacijo. Antioksidanti (še posebej -Tocopherol) odstranijo peroxylne radikale. Fosfolipidna hidroperoksidna glutation peroksidaza lahko odstrani perokside iz membrane.
Tabela 3  Popravilo oksidativne škode


Posledice oksidativnega stresa
Kljub temu, da se lahko večina tkiv prilagodi blagemu oksidativnemu stresu, lahko hud oksidativni stres povzroči celično smrt. Raziskave so pokazale, da prosta Ca2+ in železo v celici povzročata porast v koncentraciji OH˙. Nekaj hidroksilnega radikala nastane v jedru, kjer napada DNA na mnogo načinov.
Eden glavnih produktov napada OH˙ na DNA je 8-hydroksil guanin, kar pogosto privede do transverzije G  T. Prav tako lahko povečana koncentracija Ca2+ povzroči aktivacijo endonukleaz in posledično DNA fragmentacijo.
Veliko toksinov povzroča oksidativni stres medtem, ko jih metaboliziramo. Ogljikov tetraklorid je eden izmed njih: metaboliziramo ga v endoplazmatskem retikulumu. Produkt metabolizma je CCl3O2, ki je zelo uspešen pri »zagonu« lipidne peroksidacije.
Paraquat (herbicid) je še eden takšnih toksinov, ki povzroča poškodbe pljuč. Njegov metabolizem v pljučih vodi k nastanku velikih količin H2O2 in O2˙ˉ.

Kajenje prav tako povzroča oksidativni stres:
Cigaretni dim vsebuje mnogo prostih radikalov, še posebej peroksilnih (napada biološke molekule, onesposobi antioksidante, …
Prav tako dim vsebuje dušikove okside, tudi NO˙2, ki je zelo uspešen pri začetku lipidne peroksidacije.
Katranska faza vsebuje lipidotopne hidrokinone, ki so prav tako zelo uspešni pri uničevanju bioloških molekul in tkiv.
Kajenje draži pljučne makrofage tako, da začnejo proizvajati O2˙ˉ.
Kadilčeva pljuča vsebujejo več nevtrofilcev , ki prav tako proizvajajo več O2˙ˉ.
Dim prav tako vpliva na fagocite; v manjših koncentracijah jih vzpodbuje, v višjih pa zavira njihovo aktivnost.

Oksidativni stres in človeške bolezni
Oksidativni stres je neizogiben spremljevalec poškodb tkiv v času bolezni. Ob kroničnih vnetjih npr. fagociti in druge obrambne celice v telesu proizvedejo veliko količino H2O2 in O2˙ˉ, kar lahko povzroči veliko škode v telesu. Prav tako so takšne poškodbe pogoste pri revmatoidnem artritisu, vnetnih črevesnih boleznih, Kronovi bolezni, ulcerativnem kolitisu, …
bh
bh
vročina
travma
ultrazvok
infekcije
radiacija
hipertoksija
toksini
bh
bh poškodbe tkiv  povečana količina encimov, ki ustvarjajo proste radikale
 aktivacija fagocitov
 aktivacija fosfolipaz, ciklooksigenaz in lipooksigenaz
 onesposobitev in uničenje anitoksidantov
 »sproščanje« prostih kovinskih ionov
 »sproščanje« hemovih proteinov (hemoglobin in mioglobin)
 oviranje transportne verige elektronov in povečano uhajanje elektronov
Tabela 4  Kako poškodba tkiv povzroči oksidativni stres


kategorija
molekula aktivnost

encimi
superoksidna dismutaza pretvori superoksidni radikal(O2˙ˉ) v vodikov peroksid (H2O2)
glutation peroksidaze in katalaze pretvorijo vodikov peroksid v vodo in molekulski kisik (O2)

drugo
vitamin E in beta karoten reagira s prostimi radikali in tako prepreči stik radikalov z drugimi molekulami; ker je topen v lipidih, ščiti membrane
sečna kislina in vitamin C reagirata s prostimi radikali v citoplazmi
kovinski kelatorji preprečujejo železu, bakru in drugim prehodnim kovinam, da bi katalizirali oksidativne reakcije

popravilo proteinov
proteinaze cepijo oksidirane proteine
proteaze cepijo produkte proteinaz
peptidaze cepijo produkte proteaz; amiokisline lahko potem recikliramo

popravilo lipidov
fosfolipaze cepijo poškodovane dele lipidov v membranah
acetiltransferaze nadomeščajo maščobne kisline
glutation peroksidaze in transferaze pomagajo popraviti oksidirane maščobne kisline

popravilo DNA
eksonukleaze in endonukleaze izrezujejo poškodovane segmente DNA
glikozilaze in polimeraze zapolnijo luknje v DNA, ki so jih pustile endo- in eksonukleaze
ligaze povežejo vezi med deli DNA
Tabela 5  Popravljalni encimi