AKTIVACIJA GENA V DNA

Čeprav nosi vsaka celica v zarodku enake gene, se celice kasneje diferencirajo (ene postanejo nevroni, druge celice kože...). Ko embrio raste, se v različnih celicah aktivirajo različni geni, odvisno od tega, kakšne proteine bo kasneje celica sintetizirala (funkcija celice je torej s tem določena). Če želimo, da se gen aktivira, se morajo na del gena, ki se imenuje promotor, pripeti številni proteini, znani kot transkripcijski faktorji in koaktivatorji. Taka vezava omogoča encimu RNA pol ll, da prepiše gen iz DNA v RNA. Znanstvenike je zanimalo, kako transkripcijski faktor na promoterju izbere mesto kamor se bo vezal in ga razlikuje od številnih drugih mest v celični DNA. Ugotovili so, da imajo mnogi transkripcijski faktorji majhne štrline, ki jim pri iskanju in pripenjanju na vezalno mesto pomagajo. Poimenovali so jih cinkovi prsti, situirani pa so tako, da ustrezajo DNA obliki. Večina transkripcijskih faktorjev vsebuje cinkove prste, ki so sposobni prepoznavanja DNA.


Cinkovi prsti pa niso edine strukture, s katerimi se transkripcijski faktorji vežejo na DNA. Poznamo še:
• Vijačnica – zavoj – vijačnica (Helix-turn-helix) strukture
• Homeodomene
• Levcinske zadrge (Leucine zippers)
Vendar pa se cinkovi prsti pojavljajo najpogosteje.


ODKRITJE CINKOVIH PRSTOV

Prvič so v laboratoriju odkrili cinkove prste leta 1985, do danes pa so odkrili že več kot 200 proteinov, ki vključujejo cinkove prste.

Transkripcijski faktor IIIA (TFIIIA)

Leta 1980 je bil prvič razložen postopek prepisovanja (transkripcije) gena v organizmu, ki je bil kompleksnejši od bakterije. Iz žabe Xenopus laevis so izolirali protein z imenom transkripcijski faktor IIIA (TFIIIA), ki je potreben za aktivacijo gena 5S RNA. 5S RNA pa je sestavni del ribosomov, na katerem se molekule mRNA prevajajo v protein.

TFIIIA se pripne na relativno dolg odsek DNA molekule - približno 45 baznih parov, čeprav je TFIIIA sama po sebi relativno majhna molekula. Transkripcijski faktorji enakih velikosti so bili že prej odkriti v bakteriji, vendar so se ti povezali s krajšimi odseki DNA molekule (približno 15 baznih parov). Znanstveniki so se zato spraševali, kako se torej TFIIIA uspe pripeti na tako dolg del verige DNA.
Odgovor na vprašanje so našli s pomočjo v jajčnikov še nezrelih žab. Transkripcijski faktorji so ponavadi proizvedeni v majhnih količinah, TFIIIA pa je v jajčnikih še nezrelih žab v izobilju, v kompleksu s S5 RNA, kjer pomaga pri proizvodnji jajčec. Ta kompleks so znanstveniki poskušali izolirati, da bi na njem lahko preučevali tridimenzionalno zgradbo proteinov in kako se vežejo na tarčno mesto S5 RNA molekule. Toda kompleksa jim je uspeli izolirati presenetljivo malo, ker so pri tem uporabljali metodo, ki je uničila kovino, ki je sestavni del kompleksa. Ugotovili so, da je ta kovina cink (Zn). Vsaka enota TFIIIA – S5 RNA kompleksa je vključevala še med 7 in 11 cinkovih ionov.

S pomočjo encima proteaze, so TFIIIA razdelili v manjše fragmente, ki so končali kot 3 kilodaltonske enote (kilodalton – merilo molekulske teže). Te pa so se upirale nadaljnjim cepljenjem, saj so bile med sabo trdno povezane. Vsaka enota pa je bila sestavljena iz približno 30 aminokislin, ki so bile ovite okoli cinkovega iona v takoimenovano domeno.

Aminokislinska sekvenca TFIIIA

Prve tri četrtine proteina oblikujejo neprekinjeno sekvenco 9 enakih enot, po približno 30 aminokislin. Vsaka enota vsebuje tudi svoj lasten cinkov ion. Histidini in cisteini, povezani s cinkovim ionom držijo vsako enoto skupaj. Taka enota se potem neodvisno od drugih pritrdi na DNA molekulo, zato jo imenujemo na DNA vezujoča se minidomena (DNA binding minidomain), ki so jo kasneje poimenovali cinkov prst. Par cisteinov na enem koncu in par histidinov na drugem koncu enote, se pripenja na isti cinkov atom. Aminokisline, ki so vmes, pa se izvijejo navzven. V vsaki 30 AK dolgi enoti se približno 25 aminokislin poveže v strukturno domeno (cinkov prst), preostale aminokisline pa se uporabljajo kot vez, povezana med zapovrstnimi prsti. Vsaka od devetih enot vsebuje en cinkov ion, ki je povezan na dva cisteina in dva histidina. TFIIIA je torej zgrajen iz 9 cinkovih prstov. Vseh devet ima enako zgradbo, kemijska sestava pa ni enaka zaradi velike variabilnosti aminokislin, ki niso udeležene v gradnji cinkovega prsta.

KAKO PROTEINI NAJDEJO VEZAVNO MESTO NA DNA MOLEKULI

Tridimenzionalna struktura cinkovih prstov

Da pa bi lahko ugotovili, kako cinkovi prsti spoznajo pravo sekvenco baznih parov na DNA, kamor se morajo vezati, bi morali poznati točno tri-dimenzionalno strukturo cinkovega prsta.
Odkrili so jo z jedrsko magnetno resonanco na proteinu Xfin iz žabe. Karakteristične sekvence aminokislin se povežejo v kompaktno verigo s tvorbo dveh izrazitih struktur. En konec se oblikuje v dve beta verigi ki se povežeta in tvorita beta strukturo, drugi del sekvence pa se zvije v alfa vijačnico (alfa helix). Dva cisteina se nahajata na dnu beta strukture in dva histidina na dnu alfa vijačnice. Vse štiri aminokisline pa so med seboj povezane s cinkovim atomom, ki tako povezuje beta strukturo in alfa vijačnico med seboj.
Pri preiskovanju sekvence TFIIIA so ugotovili, da vsak od domnevnih cinkovih prstov vsebuje tudi set treh hidrofobnih aminokislin v navidezno identičnih pozicijah. Te aminokisline imajo zelo pomembno strukturno vlogo, čeprav so v linearnem zaporedju aminokislin precej bolj oddaljene druga od druge. Ko pa se model cinkovega prsta zvije, se hidrofobne aminokisline toliko približajo, da lahko med njimi pride do hidrofobnih interakcij. Tako se oblikuje hidrofobno jedro, ki pomaga modulu ohranjati svojo tridimenzionalno obliko.
Tako je bilo odkritih veliko proteinov, ki pa so imeli le majhen delež cinkovih prstov, v primerjavi z preostalim delom proteina. Zato je raziskovalce zanimalo, ali lahko cinkovi prsti sami vežejo protein na katerem se nahajajo na verigo DNA, ali igra pri tem kakšno vlogo tudi preostalih del proteina. Na to vprašanje so si skušali odgovoriti s pomočjo transkripcijskega faktorja SWITCH 5 (SWI5), ki vsebuje 3 cinkove prste. Izolirali so regijo, ki je vsebovala cinkove prste in jo izpostavili tarčnemu genu za protein. Če se bo ta izoliran segment povezal s tarčnim genom, potem so cinkovi prsti res sami odgovorni za vezavo proteina na DNA. In odkrili so, da morata biti prisotna vsaj dva cinkova prsta, da lahko SWITCH5 protein reagira s pravilnim odsekom DNA molekule, pri vezavi pa ne sodelujeta drug z drugim, ampak se neodvisno drug od drugega povežeta na tarčni gen. Ugotovili pa so tudi, da so cinkovi prsti res sami odgovorni za vezavo proteina na DNA.

Natančen stik med cinkovimi prsti pa še vedno ni bil določen, vse do leta 1991, ko so odkrili točna mesta vezave med cinkovimi prsti in DNA molekulo. Analizirali so jih z rentgenskimi žarki in tako določili podrobno strukturo kompleksa Zif268 (udeleženega v zgodnjem razvoju miši), ki podobno kot SWITCH5 vsebuje 3 cinkove prste. Regija proteina Zif268, ki vsebuje cinkove prste se zvije okrog enega zavoja DNA vijačnice (v obliki črke C) in se prilagaja veliki brazdi. Prsti se povežejo z deli treh baznih parov na DNA molekuli, približajo pa se ji v približno isti orientaciji. Alfa vijačnica vsakega prsta se usmeri v veliko brazdo, tako da meji na njene stene. Prvi in tretji prst Zif268 se povežeta na DNA enako. Aminokislina prvega zavoja alfa vijačnice cinkovega prsta se poveže s prvim baznim parom vezavnega mesta na DNA molekuli in aminokislina tretje zavoja se poveže s tretjim baznim parom na isti strani DNA. Drugi prst se prav tako poveže na dveh mestih poveže preko alfa vijačnica. Vendar pa se tukaj povežeta aminokisline prvega in drugega zavoja s prvim in drugim baznim parom ustreznega vezavnega mesta na DNA molekuli. (ena aminokislina se poveže z enim baznim parom). Alfa vijačnica in beta struktura v cinkovih prstih pa se povežeta tudi s fosfatnimi skupinami v obročih sladkorjev in fosfatov na molekuli DNA. Te dodane povezave pomagajo pri stabilizaciji pritrditve cinkovega prsta na DNA.


Najpomembnejše pri teh raziskavah, pa je to, da znanstveniki upajo,da bodo pomagale pri raziskavah v genetiki in tudi medicini. Namreč če bi znali oblikovati model podoben cinkovim prstom, bi lahko spoznavali točno določene DNA sekvence, s tem pa raziskovali regulacijo genov.







NASTANEK CINKOVIH PRSTOV

S stališča evolucije obstaja dober razlog da so proteini, ki se vežejo na DNA z veliko prsti, nastali z duplikacijo nekaterih prednikov genov, ki so nosili zapis za majhen protein z približno 30 aminokislinami. Iz verige sestavljene iz 30 aminokislin so se torej verjetno razvili prvi proteini, saj je bilo take proteine lahko sintetizirati. Ko je bil tak protein sintetiziran, je z lahkoto vase sprejel še cinkov ion iz okolja in ga je v svoji stabilni strukturi lahko tudi obdržal. Tako vezan je počasi pridobil zmožnost, da se je vezal na DNA ali RNA molekule. Take lastnosti pa nam pomagajo pri razlagi zakaj so cinkovi prsti danes prevladujoči tako v živalih kot tudi v rastlinah. V kolikor bi imele kake specifične DNA verige potrebo po drugačnih cinkovih prstih, bi to avtomatično pomenilo, da se bo aktiviral kak tihi gen in produciral nov encim oz. kak drug pomemben protein.

Ko so znanstveniki pridobili vpogled v strukturo in funkcijo klasičnih cinkovih prstov, jih je začelo mučiti še dejstvo, da strukture, ki so jih pravkar odkrili v TFIIIA niso bile edine strukture, ki so imele v svojem centru cinkov atom in so bile s sposobne prepoznavanja DNA.



TRANSKRIPCIJSKI FAKTORJI Z CINKOVIM PRSTOM PODOBNIMI STRUKTURAMI

Jederni hormonski receptorji

Do leta 1987 so znanstveniki odkrili zaporedje aminokislin, predstavnikov družine transkripcijskih faktorjev, ki so znani kot jedrni hormonski receptorji. Na teh so se nahajale strukture, ki so do neke mere spominjali na cinkove prste. Taki transkripcijski faktorji so vezani na določenih aktivnih genih. Pri preiskovanju teh so opazili, da vsakega od njih gradijo domene iz približno 80 aminokislin (cinkovi prsti so iz 25). Ti transkripcijski faktorji so vedno vsebovali po dve enoti katerih aminokislinsko zaporedje je spominjalo, na cinkove prste. Kot pri cinkovih prstih, tudi tukaj vsaka enota vsebuje dva para aminokislin, ki jih povezuje cink. Vendar se tukaj povezujejo štirje cisteini namesto dveh cisteinov in dveh histidinov, kot v običajnih cinkovih prstih. Te podobnosti s cinkovimi prsti na TFIIIA omogočajo, da je lahko ta 80 aminokislinski segment domena, ki se veže na DNA. Vendar pa so strukturne analize pokazale, da enote jederskih hormonskih receptorjev na DNA ne vežejo tako neodvisno kot cinkovi prsti pri TFIIIA.
Prva struktura je primarna prepoznavna enota DNA molekule.
Funkcijo druge strukture pa se da razložiti na podlagi razumevanja interakcije steroidnih receptorjev z DNA. Ti se z DNA povežejo kot par identičnih proteinskih molekul. Vsak protein v paru prepozna polovico dvodelnega vezalnega mesta, ki je poznan kot palindrom. To je del DNA, kjer je zaporedje baz simetrično, če beremo iz nasprotnih smeri na nasprotnih verigah DNA. Sekvenca baz na eni polovici je prepoznana z enim tipom transkripcijskih faktorjev (npr. estrogen receptor), lahko se natančno ujema s sekvenco, ki jo je prepoznal drug transkripcijski faktor (npr. tiroidni receptor). V tem primeru je edina razlika med dvema vezalnima mestoma le število baznih parov, ki ločujejo obe polovici v vsakem palindromu. Ker mora transkricijski faktor prepoznati pravo vezalno mesto na DNA molekuli, mora protein vsebovati regije, ki so posvečene prepoznavanju specifične polovice bazne sekvence in regije za meritev oddaljenosti obeh polovic. Za oboje odgovorna druga struktura jedrnega hormonskega receptorja.
Glukokortikoidni receptor in estogenski receptor

Leta 1990 so s pomočjo magnetne resonance razkrili zgradbo strukture, ki se veže na DNA (DNA binding domain) podganjega glukokortikoidnega (kortizone) receptorja. Kmalu zatem pa tudi zgradbo človeškega estogenskega receptorja, ki ima imajo podobno zgradbo. Obe strukturi imata cinkovim prstom podobne strukture, ki so prav tako sestavljeni iz dveh delov. Te strukture so prav tako sestavljene iz dveh delov. Prvi del se od klasičnih cinkovih prstov razlikuje po tem da je iz nepravilno zvite verige aminokislin, namesto beta strukture. Drugi del pa je še vedno sestavljen iz alfa vijačnice. Nepravilno zvita veriga nosi dve vezalni mesti za cink, preostali dve pa sta na začetku alfa vijačnice, ki sledi. Ta dva dela se združujeta v eno strukturno enoto. Zaradi hidrofobnih interakcij med aminokislinami pa se vijačnici še pravokotno prekrižata na njunih sredinah.
Raziskovalci so lahko lokalizirali tudi aminokisline, ki so ključnega pomena pri prepoznavanju DNA.
V prvi prstu podobni strukturi, ki spominja na cinkov prst, so prepoznali tri aminokisline, ki so bile sposobne prepoznavanja baznih parov na DNA. Te aminokisline se nahajajo na eni strani vijačnice v strukturi, ki jo zato imenujemo DNA prepoznavna vijačnica (DNA recognition helix). Pri križanju DNA prepoznavne vijačnice prve strukture (prsta) pa ima vijačnica druge strukture (prsta) vlogo opornika, ki drži vijačnica prve strukture (prsta) na svojem mestu. Ločevanje funkcije med obema strukturama nam pove, da drugi prst nastane s podvojitvijo prvega.

Druga prstu podobna struktura je sestavljena nekoliko drugače. Aminokisline, ki so odgovorne za prepoznavanje ležijo med prvima dvema cisteinoma. V 3D modelu se te aminokisline nahajajo v zavoju, ki ima prednost pred vijačnico za vezavo drugih molekul.

Dimerni transkripcijski faktor (sestavljen iz dveh proteinov) dobi pravilno obliko, ko se vzpostavi zveza med DNA in domenami na njem. Dva prepoznavna dela na dimeru, na katerih so prsti, se razvrstita tako, da prostor med njima ustreza prostoru med primernima polovicama na DNA (na palindromu). Vsak protein v dimeru ima tudi stike s fosfati na katerikoli strani velike brazde DNA. Tako se DNA prepoznavna vijačnica lahko usede globoko v veliko brazdo in tako tvori vezi z baznimi pari na svoji polovici.




KORISTNA SPOZNANJA

Znanje s področja transkripcijskih faktorjev in cinkovih prstov pa nam pomaga tudi pri razumevanju določenih bolezni. Tak primer je rak na ledvicah, imenovan tudi Wilmsov tumor. Ta nastane zaradi genske mutacije, ki prepreči pravilno vezavo regije, ki vsebuje cink na DNA. Pomanjkanje cinka pa povzročijo, da estrogenski in androgenski receptorji niso sposobni opravljati svoje funkcije. Podobni simptomi, pa lahko sledijo tudi nezadostnemu jemanju cinka med dieto.

V prihodnosti pa lahko tudi pričakujemo, da bodo raziskave pokazale, da cinkovi prsti oz. njim sorodne strukture ne sodelujejo le v procesu prepisovanja (transkripcije), temveč tudi pri transportu ali kakem drugem delovanju v DNA oz. RNA. Na tem področju so znanstveniki že veliko odkrili, a še več je neznanega, ki čaka da ga odkrijejo.