Aktivacija genov pri mnogoceličarjih je dandanes ena izmed najaktualnejših tem. Vse celice nosijo enak genski zapis, a se kljub temu diferencirajo v različna tkiva. Njihova usoda je odvisna od tega, katere kombinacije genov so aktivirane. Preden se gen aktivira, se morajo na njegov del – promotor – pripeti številni proteini, ki jim s skupnim imenom pravimo transkripcijski faktorji (TF). Ta sistem deluje kot stikalo, ki omogoča encimu prepis genske informacije z DNA na RNA. S transkripcijo nastala RNA največkrat služi kot predloga za sintezo proteinov (m-RNA), včasih pa je že RNA končni produkt.
Tu se pojavlja vprašanje, kako TF najde ustrezno vezavno mesto na promotorju oz. kako ga razlikuje od ostale množice DNA v celici. Izkazalo se je, da pri tem sodelujejo številne strukture, kot so: helix-zavoj-helix, homeodomene, levcinske zadrge. Še posebej veliko TF pa vsebuje majhne izbokline, imenovane cinkovi prsti.

Slika 1: Strukture, ki sodelujejo pri specifičnih interakcijah TF z DNA


ODKRITJE CINKOVIH PRSTOV

Cinkove prste so prvič odkrili v proteinu TFIIIA (slika 2) žabe Xenopus laevis. Ta protein predstavlja le enega izmed treh faktorjev, potrebnih za aktivacijo gena, ki nosi zapis za 5S RNA. 5S RNA je sestavni del ribosomov, na katerih se molekule m-RNA prevedejo v proteine.
Presenetljivo pa je bilo odkritje, da se TFIIIA veže na relativno dolg odsek DNA (obkroži približno 45 baznih parov na komplementarnih DNA verigah), čeprav je sam precej majhen. Prej odkriti TF (pri bakterijah) enakih velikosti se namreč vežejo na mnogo krajše odseke DNA (15 baznih parov).

Da bi odkrili tridimenzionalno (3D) strukturo proteina in s tem vzrok takšni razliki, so skušali izolirati čim večjo količino kompleksa TFIIIA – 5S RNA. Sprva so pridobili le malo tega kompleksa, ker so z običajno metodo pridobivanja izločili kovino, ki je celoten kompleks držala skupaj. Kasneje so ugotovili, da je ta kovina cink (Zn) in da vsak kompleks vsebuje nenavadno veliko število cinkovih ionov, od 7 do 11. V nadaljnjih poskusih so znanstveniki z encimom proteaza razcepili protein na manjše delce velikosti treh kilodaltonov, ki pa so se upirali nadaljnji razgradnji, ker so bili tesno zviti. Ti rezultati so nakazali, da je TFIIIA zgrajen iz niza enot po 30 aminokislin, od katerih je vsaka enota zavita okoli cinkovega iona v majhno, kompaktno DNA vezavno domeno.

To je vodilo do ugotovitve, da se TFIIIA razprostira vzdolž dvojne vijačnice DNA tako, da se je dotika na več mestih (zato lahko interagira s tako dolgim segmentom DNA). Vsi do takrat znani TF so se namreč vezali na DNA kot dimeri ali pari, vsak protein v paru pa se je vezal na DNA le na enem mestu. Vsa predvidevanja so dobila podporo ob odkritju zaporedja aminokislin v TFIIIA. Ugotovili so, da prve tri četrtine proteina sestavlja nepretrgan niz devetih podobnih enot iz približno 30 aminokislin. Par cisteinov in par histidinov je lokaliziran na skoraj identičnem položaju v vsaki enoti (slika 2, 4). To se sklada z ugotovitvijo, da vsaka enota vsebuje cinkov ion, saj je cink v proteinih ponavadi vezan na štiri aminokisline (običajno na štiri cisteine ali pa na kombinacijo cisteinov in histidinov).

Slika 2: aminokislinsko zaporedje TFIIIA z devetimi cinkovimi prsti


Par cisteinov na enem koncu in par histidinov na drugem koncu enote se vežeta na isti cinkov ion, kar povzroči, da se vmesna veriga aminokislin izviha in tvori zanko (podobno prstu, ki zgrabi dvojno vijačnico – slika 3).



Slika 3:

Slika 4: struktura cinkovih prstov

Na vsaki enoti iz 30 aminokislin se jih v strukturno domeno oz. prst zvije okoli 25 (del, ki tvori zanko), ostale pa služijo za povezavo med zaporednimi prsti (slika 4).
Vseh 9 enot ima torej skupno lastnost: vsebujejo par cisteinskih in par histidinskih aminokislin na dejansko identičnih mestih in tri hidrofobne aminokisline, ki pomagajo stabilizirati strukturo. Kemijsko pa se razlikujejo med seboj zaradi različnih aminokislin, ki ne sodelujejo pri formiranju ogrodja prsta (strukturnih domen).

Na vprašanje, ali tvorijo cinkovi prsti z DNA resnično ločene kontakte, pa so odgovorili s študijo prstnih odtisov (»footprinting« raziskave). Ko se protein veže na DNA, dodajo encime, ki »napadejo« DNA. Za vsak del, ki se cepitvi upre, lahko predvidevamo, da je nanj vezan protein. Ta del je torej mesto interakcije med proteinom in DNA. Metoda je pokazala, da se TFIIIA dejansko ponavljajoče veže na DNA. Takšni večkratni kontakti so tudi pojasnili, kako lahko TFIIIA interagira s tako dolgim segmentom DNA.
TFIIIA se povezuje s specifičnim področjem na DNA tako, da izkorišča verige samostojnih molekul, ki vežejo DNA.
Celice so sposobne tvoriti veliko število stikal za gene s kombiniranjem omejenega števila TF. Poleg tega pa lahko celica izdela ogromno zbirko TF s spreminjanjem izbire, vrstnega reda in števila samostojnih DNA-vezavnih modulov v proteinih. Posebna kombinacija cinkovih prstov v TF omogoči faktorju prepoznavanje specifične sekvence DNA. Tako aktivira različne kombinacije genov, to pa vodi v sintezo specifičnih proteinov, ki dajejo diferenciranim celicam značilne lastnosti. Celice so se torej na enostaven in hkrati genialen način izognile temu, da bi proizvajale TF za vsakega od ogromnega števila genov na DNA.
Cinkovi prsti se zaradi svoje učinkovitosti pojavljajo v mnogih proteinih, posebej veliko jih je v evkariontskih organizmih. Pri človeku 1 DNA določa cinkove prste (na kromosomu 19 kar 8). V enem TF pa se nahaja od 2 do 37 cinkovih prstov.
TRIDIMENZIONALNA (3D) STRUKTURA CINKOVIH PRSTOV

Da bi razumeli, kako cinkov prst prepozna specifično zaporedje baznih parov, moramo poznati natančno 3D strukturo modela prsta. Večina proteinov vsebuje lokalna področja sekundarnih struktur , ki se zvijejo skupaj v končno 3D strukturo proteina. Najpogostejši sekundarni strukturi sta α-heliks oz. α-vijačnica (protein se zvije v značilno spiralo) in β struktura (protein je iztegnjen in ima obliko lista) – slika 5.

Najprej so 3D strukturo poskusili opisati na teoretičnih temeljih, kasneje pa s pomočjo jedrske magnetne resonance (NMR), s katero se da določiti strukturo majhnih proteinov v raztopini. Slika 5:


Značilna aminokislinska sekvenca cinkovega prsta se zvije tako, da tvori dve pomembni podstrukturi. En del sekvence (začetni) cinkovega prsta prevzame obliko majhnega β lista. Sestavljen je iz dveh β struktur, ki tvorita list tako, da se druga struktura zvije nazaj na prvo. Drugi del sekvence se zvije v α-heliks. Dva cisteina se nahajata na dnu β lista, dva histidina pa na dnu α-heliksa. Vse štiri aminokisline povezuje cinkov atom – povezuje β lista in α-heliks (slika 5, 6).

NMR analiza je pojasnila tudi vlogo treh hidrofobnih aminokislin, ki jih vsak prst vsebuje na praktično enakih položajih (slika 6). Ta lastnost je nakazovala pomembno strukturno vlogo teh aminokislin. V linearni predstavitvi so hidrofobne aminokisline relativno daleč narazen, v 3D prostoru pa lahko interagirajo in sodelujejo pri zvijanju minidomen. Pri zvitju so hidrofobne aminokisline dokaj blizu skupaj in tako oblikujejo hidrofobno jedro, ki stabilizira strukturo.

Slika 6: tridimenzionalna struktura cinkovega prsta


VLOGA CINKOVIH PRSTOV PRI VEZAVI NA DNA

Znanstveniki so domnevali, da so v TFIIIA izključno cinkovi prsti odgovorni za sposobnost proteina, da prepozna promotor gena za sintezo 5S RNA. Odkrili pa so tudi veliko proteinov, v katerih je bilo prisotnih le nekaj cinkovih prstov. Zastavili so si vprašanje, ali lahko tako kratek niz cinkovih prstov poveže protein s promotorjem brez pomoči ostalih delov proteina.
Pri iskanju odgovora so iz TF kvasovk – SWITCH 5 - SWI5 (slika 7, 8) izolirali področja, ki so vsebovala cinkove prste (en TF vsebuje tri cinkove prste) in jih izpostavili promotorju ciljnega gena za protein. Izoliran proteinski segment se je hitro in z veliko afiniteto vezal na ustrezno tarčno mesto na DNA, kar nakazuje, da so cinkovi prsti sami odgovorni za vezavo na DNA. Ugotovili so tudi, da morata biti prisotna vsaj dva povezana prsta, da se SWI5 z zadostno močjo veže na pravilno ciljno mesto na DNA in da so cinkovi prsti samostojne »bralne glave«, ki so povezane preko gibljivih veznih členov.


Slika 7: shematska struktura cinkovega prsta SWI5



Slika 8: levo - 3D predstavitev 46 struktur cinkovega prsta transkripcijskega faktorja SWI5, izračunanih iz podatkov, ki so bili dobljeni z NMR
desno – aminokislinski ostanki, ki prispevajo k hidrofobnemu jedru cinkovega prsta transkrpicjiskega faktorja SWI5



Slika 9: model interakcije cinkovega prsta z DNA
Natančne stične točke med cinkovimi prsti in DNA so odkrili s proučevanjem Zif268. Tudi Zif268, podobno kot SWI5, vsebuje niz treh cinkovih prstov in je udeležen v zgodnjem razvoju miši. Rentgenska analiza je pokazala, da se regija cinkovih prstov Zif268 ovije okoli skoraj celega zavoja DNA dvojne vijačnice (v obliki črke C), tako da se prilega veliki brazdi vijačnice. Prsti kontaktirajo z zaporednimi mesti treh baznih parov na DNA. α-heliks vsakega prsta se usmeri v notranjost velike brazde, pri čemer se naslanja na eno od njenih sten.

Prvi in tretji prst se vežeta popolnoma enako: aminokislina v prvem zavoju α-heliksa se poveže s prvim baznim parom ustreznega vezavnega mesta na DNA, aminokislina v tretjem zavoju pa se poveže s tretjim baznim parom istega mesta na DNA.
Tudi drugi prst ima z α-heliksom dva kontakta, le da se v tem primeru aminokislini iz prvega in drugega zavoja povežeta s prvim in drugim baznim parom ustreznega vezavnega mesta na DNA (slika 10). Torej, v vsakem primeru je ena aminokislina v stiku z eno bazo v paru. Poleg tega se lahko tako α-heliks kot β list v prstu vežeta na fosfatno skupino v verigah sladkorjev in fosfatov, ki tvorijo stranice DNA lestve (dodatna stabilizacija).
Slika 10: vezava cinkovih prstov Zif268 na DNA

Veliko cinkovih prstov se na DNA veže podobno kot Zif268. Ko so primerjali aminokislinska zaporedja več tisoč cinkovih prstov, so ugotovili, da so aminokisline na treh mestih še posebej variabilne. Ta visoko variabilna mesta so točno tista, ki v kompleksu Zif268 vstopajo v kontakt z DNA (mesta, ki so v prvem, drugem in tretjem zavoju α-heliksa).


RAZLIKE MED TRANSKRIPCIJSKIMI FAKTORJI

Pri posplošitvi podatkov iz študij Zif268 na ostale proteine obstajajo seveda omejitve. Proteini z veliko cinkovimi prsti z DNA reagirajo drugače. Če bi ta vezavni vzorec veljal npr. za TFIIIA, bi se ta protein s svojimi devetimi cinkovimi prsti ovil okoli DNA v treh zavojih. To močno ovijanje bi oviralo odstranitev faktorja z DNA, ko bi to postalo potrebno. »Footprinting« raziskave nakazujejo, da se TFIIIA okoli DNA ne ovije nepretrgano. Prvi in zadnji trije prsti se oklenejo DNA, večina proteina pa leži na eni strani dvojne vijačnice. Različni vzorci vezave so najbrž posledica dejstva, da se aminokislinske sekvence prstov na TFIIIA bolj razlikujejo druga od druge, kot tiste na prstih proteinov tipa Zif268.


EVOLUCIJSKI POGLED NA CINKOVE PRSTE

Z evolucijskega stališča lahko razlagamo, da so večprstne domene za vezavo na DNA nastale s podvajanjem nekaterih prvotnih (pradavnih) genov, ki so nosili informacijo za sintezo majhnega proteina, dolgega približno 30 aminokislin (te verige so bile ene izmed najstarejših proteinov). Tak protein bi bilo enostavno sintetizirati, nato pa bi le-ta z lahkoto pobral cinkov ion in se zvil v stabilno konformacijo. Tako zvit bi se lahko vezal na DNA ali RNA. Te ugotovitve nam pomagajo razložiti, zakaj so cinkovi prsti tako pogosti v rastlinskem in živalskem svetu. Vsaka vrsta, ki je izdelala genetski zapis za poseben, samozvijajoč cinkov prst, si je pridobila sposobnost vezave na nov del DNA. Ta lastnost pa bi lahko botrovala pojavu novih celičnih funkcij – npr. sposobnost transkripcije nekaterih prvotno neizraženih genov in s tem produkcijo novega encima oz. proteina.


JEDRNI HORMONSKI RECEPTORJI

Cinkovi prsti niso edina struktura s cinkom, namenjena prepoznavanju DNA. Odkrili so jo namreč tudi v veliki družini transkripcijskih faktorjev, imenovanih jedrni hormonski receptorji (intracelularni receptorji). Zanje je značilno, da morajo biti vezani z določenim vitaminom, steroidnim ali tiroidnim hormonom, preden lahko aktivirajo gen.
Vsi jedrski hormonski receptorji imajo zelo podobno domeno iz 80 aminokislin. Ta domena vsebuje vedno dve enoti aminokislin, katerih zaporedje spominja na cinkov prst. Vsaka enota namreč vsebuje dva para aminokislin, ki sta vezana na cink. Razlika je v tem, da tukaj cink povezuje izključno štiri cisteine. Iz podobnosti zaporedja z vzorcem cinkovih prstov lahko sklepamo, da je ta segment proteina DNA vezavna domena (slika 11).


Slika 11: DNA vezavna domena receptorskega proteina


Oba segmenta se zvijeta v obliko prsta podobno kot pri cinkovih prstih, vendar ne delujeta kot samostojni »bralni glavi« za DNA. Kot dokaz so znanstveniki zamenjali eno aminokislino z drugo in opazovali učinek povezovanja z DNA. Ugotovili so, da prvi segment oz. prst deluje kot primarna enota za prepoznavanje DNA. Za razumevanje funkcije drugega segmenta pa moramo najprej vedeti, kako steroidni receptorji interagirajo z DNA.
Takšni receptorji se vežejo na DNA kot pari (dimeri) identičnih molekul. Vsak protein v paru prepozna polovico dvodelnega vezavnega mesta, ki ga imenujemo palindrom – slika 12 (obe polovici sta enaki, če ju beremo v nasprotnih smereh vzdolž nasprotnih verig DNA).
Slika 12: palindrom

Zaporedje baz, ki ga prepozna ena vrsta TF (npr. estrogenski receptor) se lahko popolnoma ujema z zaporedjem baz, ki ga prepozna druga vrsta TF (npr. tiroidni receptor). V tem primeru je edina razlika med dvema vezavnima mestoma število baznih parov, ki ločijo obe polovici v palindromu.
To pomeni, da lahko TF najde ustrezno vezavno mesto na DNA le pod pogojem, da protein vsebuje področja, ki prepoznajo specifična bazna zaporedja na eni polovici mesta in in tudi področja, ki merijo razdaljo med obema polovicama. Ravno merjenje razdalje je ena izmed funkcij drugega segmenta v sekvenci 80 aminokislin jedrnega hormonskega receptora.

Prepoznavanje sekvence na DNA

Prepoznavanje lahko razložimo le na podlagi poznavanja 3D strukture DNA vezavnih domen. Z jedrsko magnetno resonanco so najprej odkrili strukturo DNA vezavne domene glukokortikoidnega (kortizon) receptorja podgane (slika 14), kmalu zatem pa tudi človeškega estrogenskega receptorja (slika 13, 15).


Slika 14: glukokortikoidni receptor



Slika 13: estrogenski receptor

Oba imata zelo podobno strukturo – vsak od obeh izrastkov v domeni, ki vsebuje cinkov prst, je zgrajen in dveh delov (slika 15):
- nepravilno zavite verige aminokislin (namesto β lista v klasičnih cinkovih prstih) in
- α-heliksa.
Ta dva cinkova prsta ne ostaneta ločena, temveč se združita v eno strukturno enoto. Pri tem se oba heliksa skoraj pravokotno prekrižata v njunih razpoloviščih (zaradi interakcij med hidrofobnimi aminokislinami).
V prvi strukturi, ki je podobna cinkovemu prstu, so identificirali tri aminokisline, ki predstavljajo kritično točko v DNA prepoznavanju. Nahajajo se na eni strani heliksa, zato imenujemo to podstrukturo heliks za prepoznavanje DNA. Druga struktura s križanjem prve služi kot opora, da se heliks za prepoznavanje DNA lahko obdrži v prostoru. Igra tudi bistveno vlogo pri razlikovanju med obema polovicama mest na DNA. Aminokisline, ki so odgovorne za to razlikovanje, ležijo med prvima dvema cisteinoma na drugem delu strukture. V 3D strukturi te aminokisline tvorijo zanko, ki leži pred heliksom, kjer lahko vežejo eno molekulo z njenim partnerjem. Tako združevanje proteinov v pare, le-te pravilno orientira (slika 13, 14). Dva heliksa za prepoznavanje DNA v paru sta nameščena tako, da se razdalja med njima ujema z razdaljo med ustreznima polovicama mest na DNA.

Slika 15: estrogenski receptor

To 3D strukturo so kasneje potrdili z rentgensko analizo. Ugotovili so tudi, da se vsak protein v paru veže s fosfati na obeh straneh velike brazde. Ti stiki povzročajo, da sega heliks za prepoznavanje globoko v veliko brazdo DNA in tvori vezi z baznimi pari v palindromu.
Študije kažejo, da jedrni hormonski receptorji kljub svoji strukturni podobnosti s cinkovimi prsti v TFIIIA delujejo bolj kot DNA prepoznavni deli ostalih transkripcijskih faktorjev (levcinske zadrge, heliks-zavoj-heliks). To pomeni, da z združitvijo v eno strukturo ti segmenti pomagajo jedrnim hormonskih receptorjem pri oblikovanju parov, ki omogočijo ostalim faktorjem prepoznavanje specifičnih vezavnih mest na DNA.


BOLEZNI

Poznavanje strukture in funkcije molekul nam omogoča razumevanje raznih bolezni. Odkrili so, da je ledvični rak, imenovan Wilmov tumor, posledica genske mutacije, ki prepreči normalno vezavo cinkovega prsta v nekem proteinu z molekulo DNA.
Zaradi pomanjkanja cinka v prehrani se pojavijo nekateri simptomi, npr. zapozneli spolni razvoj, ki jih lahko pripišemo nezmožnosti estrogenskih in androgenskih receptorjev, da bi se v odsotnosti cinka pravilno zvili in posledično pravilno vezali na DNA.


ZAKLJUČEK

Cinkovi prsti, o katerih sem pisala v seminarski nalogi, se razlikujejo tako v strukturi, kakor tudi načinu interakcije z DNA. Brez dvoma bo odkritih še več razlik v razširjeni družini proteinov s cinkovimi prsti. Narava nas neprestano preseneča in hkrati zabava z genialnostjo struktur, ki jih je razvila, da je omogočila proteinom prepoznavanje specifičnih baznih sekvenc na DNA. Mnoga na novo odkrita aminokislinska zaporedja spominjajo na cinkove prste. Razlika glede na »standardne« cinkove prste je lahko v razdalji med pari cisteina in histidina ali pa v samem številu teh parov. Primer je protein kvasovk GAL4 – vsebuje šest cisteinov, ki se ovijejo okoli dveh cinkovih atomov. Znanstveniki prav tako pričakujejo odkritje vpletenosti posameznih cinkovih prstov v celične aktivnosti, ki se ne tičejo le transkripcije (npr. celični transport).





LITERATURA

- Rhodes D., Klug A., Zinc fingers, Scientific American (str. 32 – 39), februar 1993.
- Cooper M. G., The cell: A Molecular Approach, ASM Press, 2. izd., Washington, DC 2000.
- Nelson D. L., Cox M. M., Lehninger Principles of Biochemistry, Worth Publisher, 3. izd., New York, 2000.
- Internet