UVOD

Proteom
Proteom določenega organizma so vsi proteini tega organizma, ki jih proizvede tekom svojega življenja. Proteom celice ob določeni situaciji je proteinska sestava le-te.
Sama beseda je sestavljanka besed protein in genom, saj se proteomika ukvarja s preučevanjem proteinov, ki jih določajo geni.

Kaj je proteomika
Proteomika je relativno mlada veja biokemije, ki se ukvarja s proučevanjem celotnih sistemov proteinov (na ravni celice, tkiva ali organizma) – kateri proteini sestavljajo sistem in iz katerih aminokislin so zgrajeni, kakšne metabolične in signalne povezave tvorijo, kako interagirajo itn. Cilj raziskav je uporaba dognanj v zdravstvene namene- boljše razumevanje bolezenskih stanj, razvoj biomarkerjev za lažje in hitrejše prepoznavanje patoloških stanj in pospeševanje razvoja visoko-specifičnih zdravil ki bi učinkovala na molekularni ravni.
Beseda proteomika si deli koren z imenom Grškega boga Proteusa,ki je vedel vse stvari ki so se zgodile in ki se še bodo zgodile, toda tega znanja ni hotel deliti z nikomer. Tako proteomika že v imenu samem razkriva svoje bistvo – odkrivanje vseh skrivnosti ki jih skrivajo proteini.
Genske bolezni spremenijo izražanje proteinov ali njihovo aminokislinsko zaporedje in ravno tu leži prihodnost proteomike. Razumevanje delovanja proteinov bo postalo odločilno v zdravljenju bolezni na molekularni ravni.
METODE

LOČEVANJE PROTEINOV
Proteomske tehnologije so osnovane na zmožnosti ločevanja kompleksnih mešanic proteinov, tako da lahko individualne proteine lažje proučimo z drugimi metodami. Medsebojno interakcijo proteinov lahko preučujemo z različnimi tehnologijami. Najbolj pogosto uporabljena metoda separacije proteinov je 2D gelska elektroforeza.

2D GELSKA ELEKTROFOREZA

2D gelska elektroforeza osnovna metoda proteomike, saj služi ločevanju proteinov. S to metodo ločimo proteine po dveh kriterijih – glede na njihovo izoelektrično točko in glede na njihovo molekulsko maso.

Izoelektrično fokusiranje (IEF – Isoelectric focusin)
Gre za ločevanje proteinov glede na njihov naboj. Na nek stolpec ali ploskev nanesemo poliakrilamidni gel, na začetek in konec ravnine pa postavimo anodo (+) oz. katodo (-) – ustvarimo električno polje. Nato ustvarimo linearni pH gradient – tako da je pH na sredini nevtralen, proti anodi vse bolj kisel, proti katodi pa vse bolj bazičen. Gradient ustvarimo z amfoliti – manjši proteinski oligomeri z amino- ali karboksilnimi skupinami – ti potujejo do lastnih izoelektričnih točk, tako da naprimer amfolit z amino skupinami, ki lahko sprejmejo proton in tako dobijo pozitiven naboj, potuje proti katodi. Njihovemu gibanju pa vseskozi nasprotuje poliakrilamidni gel, ki deluje kot mreža, saj ustavi tiste molekule, pri katerih naboj ni dovolj močan oz. katerih masa je prevelika. Gelu lahko dodamo ureo, ki se veže na vzorčne proteine in povzroči njihovo denaturacijo (nepolarni AK ostanki postanejo topni in tako se oslabijo hidrofobne interakcije v proteinu) – zaradi tega ker vpliva na topnost proteinov, preprečuje, da bi se proteini precipitirali, nakopičili v samem gelu.
Nato v ta sistem dodamo zmes proteinov in proteini se začnejo premikati glede na njihov naboj. Vsi proteini se slej ko prej ustavijo – na primer negativni proteini potujejo proti anodi, kjer je pH vse bolj kisel. Na njih se vežejo protoni, tako da protein kmalu postane nevtralen in se ustavi. Tako dobimo več pasov proteinov, razvrščenih po izoelektričnih točkah.


Ločevanje po molekulski masi – SDS PAGE

SDS (sodium dodecyl sulfate) je detergent, ki se veže na proteine ter jih denaturira. S svojimi hidrofobni repi se zasidra v notranjost proteina, v zunanjost orientirane sulfatne skupine pa dajo proteinu negativni naboj (lastni naboj proteinov tako postane nepomemben). Ugotovili so, da se na en gram večine proteinov veže 1.4g SDS, to je približno ena molekula detergenta na vsaka dva aminokislinska ostanka. Pomembno je, da je količnik med nabojem in maso (z/m) enak in da se zaradi tega proteini premikajo le na osnovi mase ---> manjši potujejo hitreje, večji pa počasneje. Problem bi lahko predstavljali večji proteini, ki bi težje prehajali skozi gel, vendar pa SDS kot detergent spremeni konformacije vseh proteinov v trakovom podobne oblike.

Visualizacija proteinov

Po 2D gelski elektroforezi proteine označimo oz. obarvamo, da jih lahko detektiramo. Najprej so uporabljali srebrenje, ker pa nam ta metoda onemogoča kakovostno izvedbo masne spektrometrije, se zato vse pogosteje uporabljajo različna fluorescentna barvila ter tudi imuno označevanje – protitelesa, ki se nato vežejo na določeno skupino proteinov (antigenov) oz. na posamezen protein.

Izboljšave gelske elektroforeze

Uporaba »zoom« gelov – vzorec najprej na grobo profiliramo glede na izoelektrične točke. Nato pa vsak delec vzorca, ki ustreza nekemu določenemu razponu pI, dodatno profiliramo z visoko ločljivostjo z uporabo dvodimenzionalne gelske elektroforeze. Na ta način izboljšamo možnosti za odkrivanje proteinov, ki jih v vzorcu ni veliko in bi jih z navadno glesko elektroforezo težko zaznali.
Uporabnost 2D PAGE je izboljšala tudi DIGE (Differential in-gel electrophoresis) tehnika – diferencialna elektroforeza – s katero lahko na istem gelu primerjamo dva različna vzorca, ki sta obarvana s specifičnimi fluorescentnimi barvili.










MASNA SPEKTROMETRIJA

Masna spektrometrija je način ločevanja ionov glede na njihov količnik m/z (masa na naboj) S pomočjo masne analize lahko ugotovimo maso proteina ali peptida, sekvenco proteina ali peptida in jih tako na ta način identificiramo.
Masni spektrometer je ponavadi sestavljen iz treh delov – iz ionizatorja, analizatorja in detektorja (Slika 2). V ionizatorju delci dobijo naboj, ki povzroči njihov odklon v analizatorju, katerega na koncu zazna detektor. V kombinaciji z 2D PAGE tako lahko vzamemo vzorec iz “pike” na gelu, tega analiziramo z masno spektrometrijo in tako ugotovimo za kateri protein gre.

Identifikacija proteinov s pomočjo MS


Ena izmed najbolj pogostih metod prepoznavanja proteinov je preko določanja »prstnega odtisa« peptidnega fragmenta. Proteine razcepimo z uporabo proteolitskega encima kot je tripsin, da dobimo posamezne peptidne fragmente, ki so specifični za vsak protein. Nato določimo maso teh peptidov s pomočjo masne spektrometrije – sistem MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer). Molekulske mase posameznih peptidov nam pomagajo identificirati protein – iščemo lahko v internetnih podatkovnih bazah proteinov kot sta MASCOT in PROFOUND. Da določimo zaporedje AK v peptidih uporabimo posebno vrsto masne spektrometrije (tandem MS), ki nam razkrije zaporedje AK v peptidih.

BIOINFORMATIKA

Obsežne raziskave na področju proteomike imajo za posledico izjemno veliko količino informacij, ki jih je treba hitro in učinkovito interpretirati. Nato pa te podatke čimprej spraviti v obtok oz. jih narediti dostopne širokem krogu uporabnikov. Tu nastopi bioinformatika, ki je postala nepogrešljiv del proteomskih raziskav. Ta služi kot most med empirično pridobljenimi podatki v različnih vejah biologije in med informacijami ki so že na voljo, kar vodi k aplikativni uporabi znanstvenih dognanj. S pomočjo »informacijskih« tehnik (te-te izvirajo iz matematike, računalniških znanj in statistike) omogoča razumevanje in organiziranje podatkov v zvezi z molekulami v velikih količinah. Uporaba bioinformatike sega od razvoja učinkovitih programov za interpretacijo rezultatov MS do podatkovnih baz, ki vsebujejo vse informacije, ki so relevantne za določen protein. Najpogosteje uporabljane baze so SWISS-PROT, TrEMBL in NCBI. Naslednji izziv pa je podatkovna baza, ki bi zajemala tudi post-translacijske modifikacije proteinov in na podlagi slednjih omogočila napovedovanje sprememb v organizmih,ki nastanejo ob nastopu bolezni in njihovo zdravljenje.

ODKRIVANJE BOLEZNI Z RAZLIČNIMI TEHNIKAMI

Nekatere bolezni je mogoče diagnosticirati s pomočjo metod, ki jih uporabljajo v proteomiki.
Z uporabo proteinskih mikromrež lahko dokažemo prisotnost rakavih celic v prostati. Za rak na prostati sicer že obstaja specifičen antigen (PSA – Prostate Specific Antigen), ki se uporablja v diagnostične namene, toda je zelo nezanesljiv. Zgodi se da na podlagi PSA testov sklepamo, da ima pacient raka, v resnici pa ga nima. S pomočjo proteinskih mikromrež so pred krakim odkrili encim α-metilacil-CoA racemaza (AMACR), ki je konsistentno bolj izražen v rakastih celicah prostate, kot v zdravih celicah.

Z dvodimenzionalno gelsko elekrtoforezo preučujejo korelacijo med bolezenskimi stanji srca (dilatacijska kardiomiopatija) in določenimi proteini v srčni mišici.





Z uporabo DNA mikromrež v kombinaciji z 2D PAGE so ugotovili in klasificirali več vrst raka na dojkah, kar je potrdila tudi kasnejša analiza faktorja preživetja posameznih skupin žensk z določeno vrsto raka. Vse ženske so se zdravile na enak način, faktor preživetja pa se je med posameznimi skupinami zelo spreminjal in je bil v veliki meri odvisen le od vrste raka. Dognanje, da je takšno zdravljenje primerno za nekatere vrste je povzročilo iskanju optimalnejših zdravljenj za druge rste raka na dojkah.




PRIHODNOST PROTEOMIKE

Proteomika je ena izmed najbolj perspektivnih ved v biokemiji, saj bo v prihodnosti imela vedno večjo vlogo pri diagnosticiranju bolezni, velik potencial pa ima tudi na področju raziskav novih zdravil. S svojimi medtodami nam omogoča preučevanje proteinov, njihovega izražanja v različnih (patoloških) stanjih in pri različnih pogojih. Ker se ukvarja s post-translacijskimi spremembami proteinov, je zato po eni strani koristnejša kot pa genomika. Z razvojem novih tehnik bo analiza proteinov postala veliko hitrejša, količina potrebnega vzorca proteinov pa manjša.

POVZETEK
Proteomika je nadgradnja genomike in se ukvarja s preučevanjem proteinske sestave posameznih celic, tkiv ali celotnih organizmov v danem trenutku. Metoda, ki se najpogosteje uporablja pri izolaciji in identifikaciji proteinov so 2D gelska elektroforeza, ki loči proteine glede na njihovo molekulsko maso in izoelektrično točko. Tako dobljene rezultate je potrebno vizualizirati s srebrenjem ali z fluorescentnimi označevalci, da jih lahko vrednotimo s pomočjo masne spektrometrije. Ta omogoča ugotovitev mase proteina, določitev peptidnega profila in sekvence proteina in njegovo identifikacijo. Tu nastopi bioinformatika, ki omogoča računalniško analizo rezultatov in njihovo primerjavo s podatki o proteinih, ki so že določeni. Te informacije se nahajajo v nekaj obsežnih internetnih bazah podatkov, ki se jim bodo kmalu pridružile nove. Vse raziskave pa so usmerjene k odkrivanju specifičnih proteinskih sprememb ob nastopu bolezni in posledično k izdelavi zdravil, ki bi bolezni zdravila na nivoju izraženega proteina.