Uvod

Deoksiribonukleinska kislina (v znanstvenih tekstih se uporablja DNA, v poljudnih pa DNK) je dolga molekula, ki je nosilka genetske informacije v vseh živih organizmih (z izjemo nekaterih virusov, ki imajo genetsko informacijo shranjeno v obliki molekule RNA). DNA in RNA shranjujeta informacije in jih naredita dostopne celici, zatorej se morata njuni zgradbi skladati z naslednjimi pravili:

 Genetske informacije morajo biti shranjene v obliki, ki je primerne velikosti in ostane stabilna preko daljšega časovnega obdobja
 Dedne informacije morajo biti dekodirane, pogosto večkrat, da so lahko uporabne. Transkripcija je proces, pri katerem se nukleotidna zaporedja iz DNA prekopirajo na RNA, tako da lahko nadzorujejo sintezo proteinov, v procesu, ki ga imenujemo translacija
 Informacije znotraj DNA in RNA morajo biti dostopne proteinom in ostalim nukleinskim kislinam, ki morajo DNA in RNA znati prepoznati in jih povezati (velikokrat po specifičnem zaporedju) tako, da spremenijo njihovo funkcijo.
 Hčerinski organizem (hčerinska celica) mora vsebovati enaka navodila kot materinski organizem (materinska celica). DNA se zato podvaja (naredijo se natančne kopije), tako da vsaka hčerinska celica prejme enako dedno informacijo.

Struktura DNA
Nukleinske kisline so linearni polimeri z različnimi zaporedji nukleotidov (monomerov). Posamezen nukleotid je sestavljen iz treh enot:
 DUŠIKOVE BAZE (iz aromatskih cikličnih spojin, ki vsebujejo atome C in N)
Izhajajo iz heterocikličnih spojin PURINA in PIRIMIDINA. Purinski bazi v DNA sta adenin (A) in gvanin (G), pirimidinski bazi v DNA pa timin (T) in citozin (C).
 SLADKORJA – ogljikova hidrata s petimi C atomi aldopentoze (2-deoksiriboza)
V nukleinskih kislinah sta dve vrsti aldopentoz, in sicer riboza v RNA in 2-deoksiriboza v DNA
 FOSFATNE SKUPINE
DNA je polimer deoksiribonukleotidov sestavljenih v dvojno verigo, med saboj povezanih s fosfodiestrsko vezjo. Poznamo A, B in Z- DNA oblike. B-DNA je biološko najbolj pogosta oblika (oblika, ki sta jo prva opisala James Watson in Francis Crick). Tu je dvojna vijačnica sestavljena iz dveh komplementarinih polinukleotidnih verig, ovitih druga okoli druge tako, da oblikujeta strukturo, kot jo ima krožno stopnišče. Verigi sestavljata dvojno desno vijačnico, široko približno 20 Å. Pomembna sta veliki in mali žleb na zunanji strani, ki potekata vzdolž natančno urejene vijačnice. Ravnine nukleotidnih parov baz so skoraj pravokotne na os vijačnice. Med pari komplementarnih baz na nasprotnih verigah so VODIKOVE VEZI. In sicer med adeninom in timinom potekata 2 vodikovi vezi med gvaninom in citozinom pa 3 vodikove vezi. Vsak par baz ima skoraj enako širino, zato je DNK skoraj simetrična. Bazni pari A=T in G≡C se lahko medsebojno zamenjajo znotraj dvojne vijačnice brez spremembe položaja na C1 atomu sladkorno-fosfatnega ogrodja. Podobno se lahko zamenjajo partnerji para (npr A=T gre v T=A oz. G≡C gre v C≡G). Nasprotno bi katerakoli druga kombinacija baz pomembno deformirala dvojno vijačnico. »B-DNA naj bi idealno imela 10 baznih parov na obrat (helični zasuk je torej 36º na bazni par). Baze imajo Van der Waalsovo debelino 34 Å –nalagajo se druga na drugo in tvorijo stopničasto obliko. Višinsko pa se na en zavoj dvignejo za 34 Å.
Topilu so izpostavljeni samo robovi baznih parov. Dvojna vijačnica DNA zavzame značilne strukture glede na sestavo topila in zaporedje baz. Glavni strukturni varianti DNA sta še A-DNA in Z-DNA. V primeru dehidracije je B-DNA podvržena reverzibilni konformacijski spremembi v A-DNA, ki ima širšo in bolj sploščeno desnosučno vijačnico. Ima osno luknjo, pari baz pa so nagnjeni za 20º glede na os vijačnice. Posledica je globok veliki žleb in zelo plitev mali žleb.
Kdaj pa kdaj ima DNA tudi drugačno obliko. Pri visokih koncentracijah soli: (kristalna struktura zaporedja d(CGCGCG)) se DNA zasuka levosučno - Z-DNA. Ta ima 12 baznih parov višinsko stopnjo 45 Å, globok mali žleb in nobenega opaznejšega velikega žleba. Sol stabilizira Z-DNA z redukcijo elektrostatskega odboja med najbližjimi fosfatnimi skupinami nasprotnih nizov. Ne ve se ali je Z-DNA biološka pomembna. Domneva se da bi reverzibilna spreobrnitev segmentov B-DNA v Z-DNA (pod določenimi pogoji) delovala kot stikalo za izražanje genov. To pa je težko dokazati v naravi (in vivo).

ZNAČILNOST A B Z
Smer zasuka desnosučna desnosučna levosučna
Premer 26 Å 20 Å 18 Å
Št. Baznih parov na obrat 11 10 12 (6 dimerov)
Helični zasuk na bazni par 33º 36º 60º (na dimer)
Višinska stopnja 28 Å 34 Å 45 Å
Višinska stopnja na bazni par 2.6 Å 3.4 Å 3.7 Å
Kot med ravnino baznega para in osjo verige 20º 6º 7º
Veliki žleb Ozek in globok Širok in globok Ploščat
Mali žleb Širok in plitev Ozek in globok Ozek in globok
Konfiguracija sladkorja C3-endo C2-endo pirimidini C2-endo, puriniC2-endo
Glikozidna vez anti anti anti pirimidini, syn purini



Gibljivost DNA
V živih organizmih naj strukturne različice A-DNA, B-DNA ter Z-DNA ne bi prehajale prosto iz ene oblike v drugo. Prehajanje poteka pod določenimi fizikalnimi pogoji (npr. primerna vlažnost) ali pa zaradi DNA vezavnih proteinov. Prave DNA pa niso čisto take kot njihova teoretična zgradba. B-DNA se recimo razlikujejo od povprečne zgradbe v kotu med sosednjima baznima paroma, ki lahko znaša od 28° pa vse do 42° To so ugotovili z rentgenskimi žarki. Vsak par baz se lahko torej dodatno zavrti v eno ali drugo stran po principu propelerja. Nastale spremembe delov DNA so pomembne za proteine ki obdelujejo genske informacije, saj prepoznavajo različne dele DNA vijačnice.
Molekule DNA tudi niso čvrste, lahko se upognejo na nekaterih delih, da ustrezajo celicam. Ti prepogibi se večinoma zgodijo kot odgovor na vezavo specifičnih proteinov.
Obliko nukleotida opisuje 6 torzijskih kotov vezi med deoksiribozo in fosfatom, ter 1 torzijski kot med dušikovo bazo in C1 atomom deoksiriboze, ki opisuje usmerjenost baze okrog glikozidne vezi. Po teh sedmih torzijskih kotih bi se nukleotid lahko neomejeno zvijal in prepogibal, vendar ima nukleotid notranje omejitve, ki mu onemogočajo tako svobodo.
Baza prav tako ne more kar neovirano rotirati okoli glikozidne vezi (kot ). Purinski ostanki imajo namreč dve dopustno usmerjenosti, imenovani syn (z) in anti (proti) konformaciji. Pri pirimidinih je stabilna samo anti konformacija. V večini nukleinskih kislin z dvojno vijačnico so vse baze v anti konformaciji. Z-DNA je izjema, tam purin in pirimidin izmenična zavzemata anti in syn konformacijo.
Sladkor pentoza je lahko v dveh različnih oblikah, znanih kot C3-endo in C2-endo. Ti obliki pomenita, da ogljikova atoma C2 oziroma C3 ležita na isti strani pentoznega obroča kot C5 atom. Pri B-DNA se pojavlja C2-endo konformacija , pri A-DNA C3-endo konformacija, pri Z-DNA pa imajo vsi purini C3-endo, vsi pirimidini pa C2-endo konformacijo.
Če bi bili torzijski koti v sladkorno-fosfatni verigi (7 kotov) prosto vrtljivi, stabilna oblika nukleinskih kislin verjetno sploh ne bi obstajala. V resnici so ti koti omejeni zaradi nekovalentnih interakcij med riboznim obročem in fosfatno skupino. Posledica le tega je relativna togost sladkor-fosfatne verige, vendar koti le niso v celoti negibljivi.

Supernavitost DNA
DNA je zelo fleksibilna struktura, njena oblika se spreminja. Linearna oblika DNA se lahko prosto rotira in kompenzira spremembe v številu navojev molekule. Pri krožni obliki DNA pa je število navojev točno določeno.
Kromosomi mnogih virusov in bakterij so krožne molekule dvojne vijačnice DNA. Nekatere od teh molekul so lahko nenavadno zvite, temu pravimo superzvitje (supercoiling). Superzvite molekule DNA so bolj kompaktne kot sproščene molekule z istim številom nukleotidov. To ima pomembne posledice pri shranjevanju DNA v celice in pa pri razvijanju, ki se pojavi pri podvajanju in prepisovanju DNA.
Predstavljajmo si dvojno vijačnico molekule DNA, kjer sta njena konca kovalentno vezana, tako da nastane krožna dvojnovijačna molekula. Logično lahko sklepamo, da je njena geometrijska lastnost takšna, da se število njenih zavojev ne more spremeniti, ne da bi najprej prekinili eno izmed njenih polinukleotidnih verig.To lahko demonstriramo s pasom za hlače, namreč, če ga večkrat zvijemo in nato zapnemo, števila zavojev ne moremo spremeniti, ne da bi pas odpeli. To lahko izrazimo tudi matematično: L = T + W, kjer je L (linking number) število zavojev, ki jih ena veriga DNA naredi okoli druge. Tega števila ne moremo spremeniti z zvijanjem celotne molekule DNA, vse dokler kovalentno ne prekinemo ene izmed polinukleotidnih verig. T (twist) je število vseh obratov, ki jih ena polinukleotidna veriga naredi okoli osi dvojne vijačnice. Po dogovoru je T pozitiven za desnosučne vijačnice negativen za levosučne. Za B-DNA je T ponavadi število baznih parov, deljeno z 10,4 (številom baznih parov na zavoj vijačnice). W (writhing number) je število zavojev ki jih dvojna vijačnica naredi okoli spiralne osi (je merilo za superzvitje). Ko dvojna vijačnica DNA leži v ravnini, takrat je W=0.



Slika 2: zaprto krožno DNA brez superzvitja (slika desno zgoraj) lahko preoblikujemo v negativno superzvito strukturo (slika desno spodaj), tako da krožno dvojno vijačnico zvijemo z istim številom pozitivnih (desnosučnih) zavojev.





Superzvito DNA lahko spremenimo nazaj v sproščeno DNA, s pomočjo pankreasne DNaze 1, ki spada med endonukleaze (encimi, ki cepijo fosfodiesterske vezi znotraj polinukleotidne verige). Dnaza 1 cepi samo eno verigo v dvojni vijačnici DNA, kar zadostuje relaksaciji superzvitja. To pa zato, ker je sladkorno-fosfatno ogrodje nasproti zareze prosto vrtljivo okoli vezi ogrodja, kar spremeni L (število zavojev) molekule in posredno njeno superzvitje. Superzvitje ustvari napetost v DNA krogu tako kot v elastičnem traku. Zaradi tega sproščeno stanje DNA ni superzvito.
Število zavojev (L) naravnih DNA krogov je manjše od števila zavojev, ki ustrezajo njihovim sproščenim krogom. Ker DNA teži k prevzetju celotne konformacije, ki ohranja njen normalen zavoj (1 na 10,4 baznega para), so molekule negativno superzvite (W<0). Če je dvojna vijačnica razvita (T se zmanjša) potem se W poveča (L je konstanten). Sprva z razvijanjem zmanjšamo superzvitje tega kroga, a gre z nadaljnjim zvijanjem W preko ničle (sproščen krog) in nato postane pozitiven, superzvitje se zopet veča in rezultat je pozitivno zvit superheliks.
DNA funkcionira pravilno le, če je v primernem topološkem stanju. V osnovnih procesih kot sta podvojevanje in prepisovanje se polinukleotidni verigi ločita. Negativno superzvitje takšno ločevanje pojavljajočih DNA v prokariontih in evkariontih podpira, ker teži k odvijanju dvojne vijačnice (povečanju W ustreza zmanjšanje T). Če DNA primanjkuje primerna superhelična tenzija se omenjeni proces ne more dogoditi.

Topoizomeraze
Superzvijanje DNA nadzoruje skupina encimov imenovanih topoizomeraze. Imenujemo jih tako, ker spreminjajo topološko stanje krožne DNA oz število njihovih zavojev (L), vendar ne njihove kovalentne strukture. V prokariontih in evkariontih poznamo 2 tipa topoizomeraz:
1. Topoizomeraze tipa 1, ki delujejo tako, da začasno prekinejo eno verigo v DNA
2. Topoizomeraze tipa 2, ki delujejo tako, da začasno prekinejo dve verigi v DNA
Topoizomeraze tipa 1
Poznamo jih tudi pod imenom nicking – closing encymes, torej encimi, ki povzročijo odpiranje in zapiranje verige DNA. V prokariontih ti encimi katalizirajo relaksacijo negativnih superzavojev v DNA, tako da povečajo število zavojev. To počnejo dokler superzivita DNA ne preide v sproščeno stanje. V evkariontih pa lahko topoizomeraze sprostijo tako negativno kot tudi pozitivno superzvite DNA. Encimi torej prekinejo vez v eni verigi, tam se zato en zavoj odvije, veriga pa se nato znova zapečati. Dvojna vijačnica, ki je najprej imela n zavojev, preide tako v stanje, kjer ima n-1 zavojev.
Topoizomeraze tipa 2
So polimerni encimi, ki za svoje delovanje porabljajo energijo ATP. Tu gre za cepitev dveh verig DNA, ti se odvijeta in nato znova zapečatita. Pri tem tipu topoizomeraz lahko tako prokariontski kot tudi evkariontski encimi sprostijo negativno in pozitivno superzvite vijačnice DNA, vendar so le prokariontski encimi (DNA giraze) sposobni narediti negativno superzvite vijačnice.
Površinsko so topoizomeraze tipa 2 podobne tistim tipa 1; vse imajo par katalitičnih ostankov tirozina, ki tvorijo začasne kovalentne razcepe na 5 koncih vijačnice DNA. Z cepitvijo obeh verig v dvojni vijačnici, nastanejo štirje lepljivi konci. Te topoizomeraze imajo v svoji zgradbi luknjo, ki je široka 55 A° in visoka 60 A°, kar je mnogo večje od premera verige B-DNA. Encimi tipa 2 so sposobni cepiti obe verigi DNA, ne morejo ju pa odviti brez pomoči ATP. Pri delovanju tega encima sodelujeta dve dvojnovijačni verigi DNA.
Topoizomeraza veže nase prvo DNA, ki jo cepi s pomočjo energije iz ATP. Druga DNA pa se vstavi v luknjo v encimu. Cepljena DNA se nato zopet zlepi, druga pa zapusti kompleks skozi nasprotno stran, od koder je prišla.
Inhibitorji topoizomeraz tipa 2 kot antibiotiki in sredstva za zaviranje raka
Pomembnost topoizomeraz, ki vzdržujejo DNA v primerni topološki obliki dokazuje dejstvo, da obstaja mnogo antibiotikov, ki so prevzaprav inhibitorji topoizomeraz. Ti inhibitorji se npr. uporabljajo za zdravljenje raka (kemoterapija). Torej gre za inhibitorje topoizomeraz tipa 2.
Inhibitorji topoizomeraz tipa 2 delujejo na dva načina. Nekateri (novobiocin) inhibirajo ATP-azno aktivnost topoizomeraze. S tem se zmanjša celotna aktivnost topoizomeraze, kar pomeni, da posledično zastane podvajanje in transkripcija RNA. Drugi inhibitorji (ciprofloxacin, doxorubicin) pa povzročijo, da topoizomeraze tipa 2 povečajo cepljenje nukleotidnih verig DNA ter zmanjšajo ponovno zlepljenje teh verig. V DNA torej ostajajo nepovezani deli, kar pomeni, da je DNA poškodovana, kar povzroči celično smrt.

Povzetek
Deoksiribonukleinska kislina DNA predstavlja osnovni vir bioloških informacij. DNA je nerazvejan polimer, katerega osnovna enota je nukleotid. Nukleotid v DNA je sestavljen iz sladkorja (deoksiriboza), dušikove baze (adenin, citozin, gvanin in timin) in fosfatne skupine. Zaporedje nukleotidov določa pomen genske informacije. V vseh živih organizmih (z izjemo nekaterih virusov) se DNA nahaja v obliki dvojne vijačnice, pri tem se adenin vedno povezuje s timinom in citozin vedno z gvaninom (Watson-Crickovo pravilo baznih parov).
Poznamo A, B, in Z oblike DNA. V B-DNA obliki, ki je v naravi najpogostejša, se dve verigi spiralasto zvijata okoli skupne osi po principu desnosučnosti, njune polinukleotidne baze pa so specifično povezane z vodikovimi vezmi ter praktično pravokotne na os molekule, kar vijačnici omogoča konstantno širino. B-DNA vijačnica ima 10 baznih parov na obrat in višinsko stopnjo 34 Å (1 Å = 0.1 nm) . Ima mali in veliki žleb. A-DNA je širša in bolj sploščena desnosučna vijačnica in ima 11 baznih parov na obrat in višinsko stopnjo 28 Å, kar ji daje osno luknjo. Osni nagib baznih parov leži v kotu 20º glede na os vijačnice. Ker os ne poteka skozi bazne pare, ima A-DNA globok veliki žleb in zelo plitev mali žleb. Z-DNA je pa levosučna dvojna vijačnica. Ta ima 12 baznih parov, višinsko stopnjo 45 Å, globok mali žleb in nima opaznejšega velikega žleba.
Resnične DNA molekule odstopajo od opisanih idealnih struktur. Deli molekul se razlikujejo od idealnih konformacij in sicer v odvisnosti od zaporedja nukleotidov. Konformacija nukleotidne enote je določena s 7 koti prostostnih stopenj, rotacija baze okoli glikozidne vezi pa je močno ovirana. Purinski ostanki imajo tako 2 sterično sprejemljivi orientaciji: syn in anti konformacijo (samo anti konformacija pirimidinov je stabilna). Ribozni obroč je tudi omejen, zato se rahlo naguba oz. odkloni iz planarne oblike. Dve najbolj znani konformaciji riboze sta C3- in C2-endo riboza. Vse to pa pomeni relativno togost sladkor-fosfatne verige.
Do superzvitja pride pri krožni DNA. Superzvite molekule DNA so bolj kompaktne kot sproščene molekule z istim številom nukleotidov. To ima pomembne posledice pri shranjevanju DNA v celice in pa pri razvijanju, ki se pojavi pri podvajanju in prepisovanju DNA. Pojav opišemo z izrazom L = T + W, kjer je L (linking number) število zavojev, ki jih ena veriga DNA naredi okoli druge, T (twist) je število vseh obratov, ki jih ena polinukleotidna veriga naredi okoli osi dvojne vijačnice, W (writhing number) pa je število zavojev ki jih dvojna vijačnica naredi okoli spiralne osi.
Superzvitje nadzorujejo posebni encimi – topoizomeraze in sicer topoizomeraze tipa 1, ki delujejo tako, da začasno prekinejo eno verigo v DNA in topoizomeraze tipa 2, ki delujejo tako, da začasno prekinejo dve verigi v DNA in za svoje delovanje porabljajo energijo ATP.
Topoizomeraze tipa 2 so zelo pomembne tudi z drugega vidika, namreč inhibitorji le- teh so pravzaprav mnogi antibiotiki, tudi zdravila, ki se uporabljajo pri zdravljenju raka (kemoterapiji). Ti zmanjšajo aktivnost topoizomeraze in posledično tudi podvajanje in transkripcijo DNA.