TRANSKRIPCIJSKI FAKTORJI (TF)

Transkripcijski faktor je v molekularni biologiji protein, ki veže DNA na specifičnem mestu, kjer uravnava prepisovanje. TF lahko selektivno aktiviramo ali deaktiviramo z drugimi proteini. Transkripcija pa je proces prenosa genske informacije z DNA v RNA in je začetek dogajanja, ki na koncu povzroči translacijo genske kode v funkcionalen peptid ali protein. Transkripcija poteka v smeri od 5 do 3 (star protein se bere s smeri od 3 do 5, novi fragmenti pa nastajajo v prej omenjeni smeri).
TF se veže na DNA molekulo, prekine H-vezi med bazami in tako pomaga RNA polimerazi, da se ta veže na DNA. RNA polimeraza prepozna določeno promotorsko regijo v DNA, ki je v tem trenutku še dvojna vijačnica. DNA se odvije in postane enojna. RNA polimeraza prepiše DNA, novovezani nukleotidi se povežejo v enojno verigo RNK. Ta se nato odcepi od DNA in preide skozi poro jedrnega ovoja v citoplazmo, kjer se s pomočjo rRNA veže na ribosome. Aminokisline, ki se na ribosomih povežejo v beljakovine, tja prinesejo tRNA; trojica nukleotidov na tRNA, ki se poveže s kodonom, imenujemo antikodon. Vse zapise skupaj, ki so kodirani v DNA, imenujemo genski kod. Kodirano sporočilo se iz zaporedja nukleotidov prepiše v zaporedje aminokislin.

Primerjava zaporedij različnih TF kaže na to, da lahko najdemo motive (»motifs«) s podobno sestavo, ki so odgovorni za vezavo na DNA. Ti so ponavadi kratki, sestavljajo majhen del proteinske strukture in so odgovorni za aktiviranje prepisovanja preko interakcije med proteini prepisovalnega aparata.
Poznamo več skupin proteinov, ki regulirajo transkripcijo preko posebnih motivov:
- steroidni receptorji
- cinkovi prsti
- vijačnica – obrat - vijačnica
- levcinska zadrga

Aktivnost posameznega TF lahko uravnavamo na več načinov:
- aktivnost faktorja lahko nadzorujemo z modifikacijo
- faktor se aktivira ali deaktivira če vežemo nanj ligand (npr. steroidni receptorji). Vezava ligandov lahko vpliva na lokalizacijo proteina in določa zmožnost vezave na DNA
- transkripcijski faktor nastane kot protein vezan na jedrno ovojnico in ER
- odsotnost sterolov povzroči da se citosolna domena ukrivi; tako se ta veže na jedro in aktivira TF
- dimerni faktorji imajo alternativne partnerje; eden ga lahko naredi neaktivnega, sinteza aktivnega partnerja pa lahko nadomesti neaktivnega

CINKOVI PRSTI

Protein je sestavljen iz zaporedja različnih aminokislin in ima N (NH2) in C (COOH) konec. Določeno zaporedje v njem pa je zmožno vezati cink ion in tako oblikovati samostojno domeno v proteinu. Te domene imenujemo zaradi njihove strukture cinkovi prsti; podobno strukturo lahko najdemo tudi v steroidnih receptorjih in v klasičnem proteinu s cinkovim prstom. »Prstni protein« je sestavljen iz večih cinkovih prstov in konstantnega zaporedja, ki se ponavlja skozi celoten protein.
Cinkov prst imenujemo tudi C2H2 prst. Cink se znajde v tetraedrični strukturi, ki jo sestavljajo cisteinski in histidinski ostanki. Sestavljen je iz približno 23 aminokislin; med posameznimi prsti pa je ponavadi 7-8 aminokislin. Pogosto se pojavijo kot motivi v DNA-vezavnih proteinih. Prst je ponavadi organiziran kot ponavljajoča se serija; v proteinu se lahko pojavi več kot le en prst (npr. protein lahko sestavlja 9 cinkovih prstov ali pa le majhna domena, ki je sestavljena iz dveh prstov).
TF Sp1 ima na primer 3 cinkove prste. N konec proteina oblikuje -list, C konec pa sestavlja -vijačnica. Tri -vijačnice se prilagajo enemu zavoju DNA molekule; vsaka -vijačnica se veže z dvema vezema. Znanstveniki predvidevajo, da so določene aminokisline na -vijačnici odgovorne za prepoznavanje specifičnih tarčnih mest.


TF s prstom C2H2

TF TFIIIA igra pomembno vlogo pri regulaciji transkripcije 5S ribosomalnega RNA gena z RNA polimerzazo III. Molekula TFIIIA ima ponavljajočo se strukturo, ki se v njej ponovi devetkrat, in vsebuje od 7 do 11 atomov cinka. Struktura, ki se ponavlja, vsebuje dva negibljiva cisteina in dva negibljiva histidina, in veže en atom cinka. Takšno strukturo so potrdili z absorpcijsko spektroskopijo TFIIIA proteina. Cinkove prste s podobno strukturo najdemo ne le v RNA polimerazi III, temveč tudi v številnih RNA polimerazah II (npr. Sp1 v človeku ali Kruppel protein v Drosophili).
Ugotovili so, da je povezovanje DNA molekul odvisno od aktivnosti TF. Pri TFIIIA je sposobnost vezave na DNA odvisna od prisotnosti cinka. Če cinka primanjkuje ali pa se izgublja, molekula hkrati izgublja svojo sposobnost vezave na DNA. Podobno je v primeru Sp1, le da lahko pride do vezave četudi je prisoten le del proteina, ki pa vsebuje cinkov prst.
Kruppel protein je pomemben TF pri muhi Drosophila in je pomemben za pravilen razvoj trebušne votline in prsnega koša. Ugotovili so, da pride do hudih mutacij če en cistein nadomestimo s serinom. Posledice so podobne tistim, ki bi nastale če bi gen popolnoma odstranili iz organizma, kar kaže na pomembno vlogo cinkovih prstov. Pri preučevanju ADR1 proteina so ugotovili, da se je samo en cinkov prst nezmožen vezati na DNA, kar govori o tem, da je za vezavo potrebna prisotnost večih cinkov prstov.

VEZAVA DNA S C2H2 PRSTOM

Struktura z cinkovimi prsti služi kot vmesnik in se direktno poveže z DNA. Podrobna analiza je pokazala, da aminokisline ne oblikujejo preproste »obrat« strukture, kot so to predvidevali. Prst tvori motiv, ki je sestavljen iz dveh antiparalelnih -listov s sosednjo -vijačnico, ki se poveže z eno stranjo -lista. Ko se prst poveže z DNA, -vijačnica leži na velikem zavoju DNA in z njim tvori vezi, medtem ko -list leži stran od DNA in je v kontaktu s hrbtenico DNA. Takšna struktura ponazarja pomembno vlogo aminokislin na amino terminu -vijačnice.
Dve aminokislini te regije igrata pomembno vlogo pri določevanju DNA vezave TF Krox-20. Ta faktor vsebuje 3 cinkove prste, ki se vežejo na določeno DNA zaporedje (npr. 5 GCGGGGGCG 3). Centralni prst mora prepoznati zaporedje GGG, zunanja prsta pa vsak zaporedje GCG. S poskusi so ugotovili, da se vsak prst veže s tremi bazami DNA. Pravtako so hoteli ugotoviti kako je zaporedje v proteinu pomembno pri vezavi na DNA in tako prišli do rezultata, da drugačno zaporedje na TF povzroči vezavo na drugo zaporedje v DNA.

VEČ CISTEINSKI PRSTI

Steroidni receptorji

Steroidni hormoni so skupina substanc, ki izvirajo iz holesterola in vplivajo na različne biološke procese, kot so rast, metabolizem in spolna diferenciacija. Zgodnje raziskave s pomočjo radioaktivno označenimi hormoni so pokazale, da ti delujejo preko vezave na specifične proteinske receptorje. Vezava hormona na receptor povzroči njegovo aktivacijo in mu omogoči vezavo na omejeno število specifičnih mest v kromatinu. Vezava na DNA aktivira transkripcijo genov, ki nosijo receptorsko vezavno mesto. Receptorski proteini in TF postanejo aktivirani ob določenemu signalu in aktivirajo specifičen gen. Ti receptorski proteini so bili med prvimi TF, ki so jih prepoznali in sicer s pomočjo radioaktivno označenih steroidnih ligandov. Geni, ki jih inducirajo specifični steroidni hormoni, vsebujejo specifično vezavno mesto za kompleks receptor-hormon. Odgovori na različne steroidne hormone so uravnavani s palindromičnimi zaporedji (npr. perica reže raci rep), ki so med sabo povezani.
Bazo vezavnega mesta so določili, ko so klonirali gen, ki kodira receptorske proteine. Ugotovili so, da ti geni pripadajo družini, ki kodira sorodne proteine s podobno strukturo z regijami, ki so povezane z vezavo DNA ali hormonov. To je vodilo k ideji, da so ti receptorji kodirani z evolucionarno povezano gensko družino, ki jo poznamo kot steroid-tiroid hormonska družina. Receptorji so zmožni vezave na podobna DNA zaporedja. Receptor se veže na DNA kot dimer; vsaka receptorska molekula se veže na eno polovico prepoznanega zaporedja.

OSNOVNA DNA VEZAVNA DOMENA

Z analizo jedrnega receptorja DNA vezavnih domen so prišli do ugotovitve, da obstaja podoben motiv, ki veže nase cinkov ion. Tako kot pri C2H2 prstih, so preko absorpcijske spektroskopije ugotovili, da motiv veže cink v tetraedrični konfiguraciji. Ampak v tem primeru namesto dveh cisteinov in dveh histidinov, cink vežejo štirje cisteini. V primeru jedrnih receptorjev ima DNA vezavna domena določeno ponavljajočim zaporedjem. Motiv je tako zmožen formiranja para prstov, vsakega s cinkom vezanim med štiri cisteine. Tako kot pri prstih C2H2 je vezava odvisna od prisotnosti cinka.
Ne moremo pa dveh cisteinov kar tako zamenjati s histidinom, kar kaže na to, da imata ta dva prsta različne funkcije. Pravtako lahko v molekuli proteina najdemo samo en cink prst, medtem ko je v proteinih s C2H2 prisotno več cinkovih prstov. Študije strukture več-cisteinskih prstov v glukokortikoidnih in estrogenskih receptorjih so pokazale, dva prsta oblikujeta en sam strukturni motiv, ki je sestavljen iz dveh -heliksov, ki pa sta med sabo povezana s še eno cistein-cink vezjo in tako držita začetek zaskua na N terminu vsakega heliksa. Ta struktura je v nasprotju s tisto pri C2H2, kjer je vsak prst samostojna struktura in katerega konfiguracija ni odvisna od prisotnosti ali odsotnosti sosednjih prstov.
Čeprav si sta si prsta C2H2 in C4 podobna v njuni konfiguraciji cinka, se razlikujeta med sabo v strukturi, pomanjkanju histidinov pri C4 prstu in vsebnosti fenilalaninskih in levcinskih ostankov. Tako vsak zase predstavlja samostojen funkcionalen element in si tako nista evolucijsko povezana. Mutacije, ki odstranijo ali poškodujejo kritične aminokisline v motivu, preprečijo DNA vezavo teh receptorjev.

LEVCINSKA ZADRGA

Levcinska zadrga je levcinsko bogata regija, saj se levcin ponovi vsakih sedem aminokislin. Ima strukturo -heliksa, pri katerem se sosednji levcinski ostanki ponovijo na vsake dva obrata na isti strani heliksa. Ostanki igrajo pomembno vlogo pri funkciji proteina.
Odkrili so, da se stranske verige levcinskih ostankov enega polipeptida povežejo z analognim heliksom drugega polipeptida in tako oblikujejo motiv, ki je znan kot levcinska zadrga (dimer). Isti rezultat lahko dosežemo z metoninskimi ostanki, ki imajo dolgo verigo in nobene lateralne metilne skupine; vendar pa do istega efekta ne pridemo, če zamenjamo levcin s valinom ali isolinom.
Substitucija posameznih levcinskih ostankov onemogoči zmožnost intaktnega proteina, da bi tvoril dimer, kar kaže na pomembno vlogo tega odseka pri polimerizaciji. Primerjava vpliva različnih mutacij na sposobnost dimerizacije govori o tem, da se levcinsko bogata regija paralelno poveže z obema heliksoma orientiranima v isto smer. Vsak motiv oblikuje -heliks, dimerizacija pa poteka s povezovanjem dveh paralelnih heliksov, ki se ovijeta eden okoli drugega.
Levcinska zadrga se direktno sama ne veže na DNA, temveč igra vlogo indirektne strukture pri DNA vezavi in usmerja osnovne DNA vezavne domene, da se te pravilno vežejo in tako povzročijo vezavo DNA. Mutacije v osnovni domeni tako uničijo zmožnost, da se ta veže na DNA, vendar pa ne vplivajo na dimerizacijo proteina.
Specifičnost DNA vezave je določena z zaporedjem osnovne domene in z dovoljenjem levcinske zadrge da poteče dimerizacija. Osnovna DNA vezavna domena lahko interagira z DNA v specifičnem zaporedju tudi brez levcinske zadrge, če je na začetku dimerizirana preko intermolekularne disulfidne vezi. Vezavna domena se lahko veže na DNA kot monomer, če TF nima levcinskih zadrg. Osnovna vezavna domena je del cDNA vezavne domene, ki vsebuje regijo, ki je homologna N-termisu .
Faktorji, ki imajo preprosto osnovno DNA vezavno domeno, in sledijo dimerizaciji preko levcinske zadrge, bodo oblikovali rotacijsko simetričen dimer, ki bo vezal DNA preko bifurkatne osnovne regije, ki tvori -helikse. Ta dva heliksa nato sledita vzdolž DNA v nasprotni smeri in formirata škarjam podobne klešče okoli DNA, ki povzroči da se protein tesno veže nanj. Študije strukture so pokazale, da osnovna domena ne oblikuje popolne -heliks strukture, dokler se ne poveže z DNA molekulo, in se takrat spremeni v popolno -helično obliko in tako nastane tesna povezava med TF in DNA.

ZNANOST IN MEDICINA

S pomočjo cinkovih prstov lahko uravnavajmo aktiviranje določenih genov, ki se vežejo na DNA molekulo. Pri pacientih, ki trpijo za slabo oskrbo tkiv preko ožilja, lahko s pomočjo TF, ki aktivirajo določen gen, povzročimo rast novih krvnih žilic. Cinkove prste pa lahko uporabimo tudi takrat, ko želimo blokirati določeno infekcijo celic zaradi specifičnih človeških virusov. Prsti namreč blokirajo transkripcijo genov na katere se vežejo.
Znanje TF nam pomaga tudi pri razumevanju določenih genskih bolezni. Primer je Wilmsov tumor (rak na ledvicah), ki nastane zaradi genske mutacije, ki prepreči vezavo regije s cinkom, na DNA. Pravtako lahko pomanjkanje cinka povzroči, da estrogenski in anrogenski receptorji niso sposobni opravljati svoje funkcije. Posledica tega je lahko zapoznel spolni razvoj, saj se endrogenski in androgenski receptorji v odsotnosti cinka nepravilno zvijejo in se ne vežejo na DNA.

POVZETEK
- TF se aktivira ali deaktivira če vežemo manj ligand
- Pri cinkovih prstih se cink znajde v tetraedrični strukturi, ki jo sestavljajo cisteinski in histidinski ostanki
- cink je pomemben za vezavo proteina na DNA; če ga ni, se cinkovi prsti ne tvorijo in protein se ni zmožen vezati na DNA
- če v prstu nadomestimo kakšen cistein, so posledice enako hude, kot če bi gen popolnoma izbrisali iz organizma
- zaporedje aminokislin v proteinu je zelo pomembno; drugačno zaporedje povzroči, da se TF veže na drugačno zaporedje v DNA in tako povzroči drug rezultat transkripcije
- steroidni receptorji se vežejo na DNA kot dimeri; vsaka receptorska molekula se veže na eno polovico prepoznanega zaporedja
- pri cinkovih prstih C2H2 je pomembno, da je morajo biti v proteinu prisotni v večjem številu; v primeru prsta C4 pa je ta lahko sam; pravtako so si C4 prsti med sabo funkcionalno povezani, medtem ko prsti v C2H2 ne vplivajo eden na drugega
- levcinska zadrga se, v nasprotju z ostalimi TF, sama ne veže na DNA, temveč se veže na osnovne DNA vezavne domene
- kakršnekoli mutacije v TF povzročijo, da se ti ne vežejo ali pa se vežejo na drugačno zaporedje DNA; pomanjkanje cinka vpliva na nepravilno zvijanje hormonskih receptorjev in to lahko povzroči nastanek različnih bolezni

LITERATURA
- B. Lewin. Genes VII. Oxford United press. 2000.
- D. S. Latchman. Eukaryotic Transcription factors. Elsevier Academic Press, 4th edition. 2004.
- P. Stušek. Biologija : učbenik za splošne gimnazije. Celica. Ljubljana : DZS, 2003.
- http://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_28genetics29
- http://en.wikipedia.org/wiki/Transcription_factors