I. TEMELJNE ZNAČILNOSTI PLAZEMSKIH PROTEINOV

Plazemske proteine razdelimo v pet frakcij z elektroforezo krvnega seruma. Elektroforeza poteka na nosilcu-agaroznem gelu ali acetatni celulozi, po katerem potujejo proteini z različno hitrostjo, odvisno od njihove velikosti in naboja. Predhodno je potreben alkalni medij, ki zagotovi negativen naboj proteinom, da bodo potovali proti anodi. Proteini iste frakcije bodo potovali z enako hitrostjo, saj imajo sorodne lastnosti, zato dobimo pet različnih pasov na elektroferogramu. Gel obarvamo in preko merjenja absorbance različnih frakcij izdelamo denzitogram. Iz razmerja med površino posameznega vrha in celotno površino pod krivuljo denzitograma je razviden delež, ki ga predstavlja neka frakcija v primerjavi s celotno količino proteinov (SLIKA 1).




















SLIKA 1: Elektroferogram in denzitogram krvnega seruma


ALBUMIN
Albumin, protein z relativno nizko molekulsko maso, predstavlja 55-60 vseh plazemskih proteinov in je edini predstavnik, ki sestavlja to frakcijo. Glavni funkciji sta vzdrževanje koloidno osmotskega tlaka in transport določenih nizkomolekularnih substanc.
Zaradi pomembnih funkcij albumina je njegova koncentracija natančno uravnavana s tremi mehanizmi:
1. hitrost razgradnje je pogojena z velikostjo zaloge albumina ( pri majhni zalogi je plazemski razpolovni čas podaljšan, pri veliki zalogi pa skrajšan );
2. zmanjšanje količine albumina v plazmi vodi do povečanega prestopanja albumina iz intersticija, kjer je 60 vse zaloge albumina v telesu;
3. sinteza albumina v jetrih je odvisna od onkotskega tlaka v plazmi, ki vpliva na intersticijski onkotski tlak, ta pa na sintezo v jetrih; tako je pri zvišanem onkotskem tlaku v plazmi sinteza zmanjšana, pri znižanem pospešena . Normalna in pospešena sinteza sta odvisni tudi od zadostnih zalog aminokislin in razpoložljive energije.



GLOBULINI α1
Ti proteini predstavljajo najmanjši delež v plazmi. Količinsko so v ospredju lipoproteini α1 , sledi antitripsin, ki je pomemben inhibitor proteaz, in glikoprotein α1, ki vsebuje visok delež ogljikovih hidratov, njegova funkcija pa še ni znana.

GLOBULINI α2
Haptoglobin, ki spada v skupino globulinov α2, veže hemoglobin, ki se sprosti iz propadlih eritrocitov. Ceruloplazmin je pomemben za vezavo bakra v serumu. Makroglobulin α2 spada k visokomolekularnim plazemskim proteinom in deluje kot inhibitor proteaz, zlasti plazmina in trombina.

GLOBULINI β
V ß frakciji so količinsko glavni lipoproteini ß, sestavljata pa jo tudi transferin in hemopeksin. Hemopeksin je nizkomolekularen glikoprotein in veže prosti hem v molskem razmerju 1:2 (hemoglobina in citokromov ne veže). Transferin je glavni prenašalec železa in predstavlja znaten delež frakcije β. V to frakcijo spadajo tudi komponente sistema komplementa.

GLOBULINI γ
Predstavljajo jih imunoglobulini. Po molekulski masi in vsebini ogljikovih hidratov jih razdelimo v razrede: IgG, IgA, IgD, IgE in IgM. IgG je prototip imunoglobulinov. Sestavljata ga dve lahki in dve težki verigi. Lahki verigi vsebujeta po en konstantni in en variabilni del, težki pa tri konstantne in po en variabilni del. Konstantna dela težkih verig in konstantni deli težkih ter lahkih verig so medseboj povezani z disulfidnimi mostički. Variabilni deli nosijo točno določeno sekvenco aminokislin za visoko specifično vezavo antigena. Imunoglobuline proizvajajo plazmatke, ki nastanejo iz limfocitov B. Po vezavi antigena na zanj specifičen receptor na površini se le-te delijo in ustvarijo klon celic, ki proizvajajo vse le eno vrsto protitelesa, specifično za ta antigen (klonska teorija).


II. KVANTITATIVNE SPREMEMBE PLAZEMSKIH PROTEINOV
Celokupna koncentracija plazemskih proteinov znaša 67-84g/l (v serumu 63-80g/l). Odstopanja od teh vrednosti vodijo v hiper- ali hipoproteinemijo, ki sta lahko absolutni (gre za spremembo količine proteinov) ali relativni (gre za spremembo volumna plazme). Vrsto proteinemije potrdimo z določanjem hematokrita, ki je pri relativnih spremembah ustrezno spremenjen.

-RELATIVNA HIPOPROTEINEMIJA nastane, kadar pride do zadrževanja vode in elektrolitov v plazmi (infuzija, anurija, popuščanje srca);
-RELATIVNA HIPERPROTEINEMIJA nastane pri zmanjšanju volumna plazme (dehidracija);
-ABSOLUTNA HIPOPROTEINEMIJA je posledica povečane izgube albumina v organizmu preko kože (opekline), ledvic (nefrotski sindrom) ali v črevesju, povečanega katabolizma (infekcije, poškodbe), zmanjšane sinteze proteinov (hepatitis, malnutricija, malabsorbcija);
-ABSOLUTNA HIPERPROTEINEMIJA je posledica porasta ene ali več patoloških komponent Ig sistema (paraproteinemija).






III. KVALITATIVNE SPREMEMBE PLAZEMSKIH BELJAKOVIN

Mednje spadajo paraproteinemije, disproteinemije in bolezni povezane z izgubo posameznih plazemskih beljakovin.
Te spremembe diagnosticiramo s serumsko elektroforezo in imunoelektroforezo. Spremembe koncentracij posameznih funkcionalno pomembnih plazemskih beljakovin dokažemo na podlagi biološke aktivnosti; če manjkajo, izostane tudi ustrezna aktivnost (npr. faktorji strjevanja).

PARAPROTEINEMIJE
Paraproteini( komponenta M, monoklonski imunoglobulini)
Vzrok bolezni je tumorska proliferacija enega klona plazmatk, ki proizvajajo eno samo monoklonsko protitelo brez antigenske specifičnosti ali njegov sestavni del - lahko ali težko verigo. Paraproteini so lahko torej po zgradbi enaki imunoglobulinom ali pa le del imunoglobulina. Na elektroforeznem diagramu se monoklonsko protitelo vidi kot oster zobec- zobec M v področju globulinov γ, ker vse molekule potujejo enako hitro. Za podrobnejšo analizo je potrebna imunoelektroforeza oz. še bolj natančna metoda imunofiksacija. Sinteza normalnih imunoglobulinov je zavrta (tumorsko inducirana supresija), razgradnja pa pospešena( razgradnja je povezana s serumsko koncentracijo).

MONOKLONSKA IMUNOGLOBULINEMIJA NEDOLOČENEGA POMENA (MONOKLONSKA GAMOPATIJA NEDOLOČENEGA POMENA, BENIGNA MONOKLONSKA GAMOPATIJA)
Pomeni prisotnost MIg v serumu ali urinu, ki je tudi edini pokazatelj bolezni. Drugih kliničnih manifestacij ni: odsotnost osteoliz ali drugih znakov plazmocitoma ali sorodnih bolezni. MIg so največkrat razreda IgG, IgA, IgM. Diagnostični kriterij je koncentracija MIg v serumu <30g/l, izločanje MIg v urinu <1g/dan, delež plazmatk v kostnem mozgu pa <10. Pogostost bolezni s starostjo narašča. Kontrola proliferacije plazmatk je pomanjkljiva, ni pa še maligna. Po daljšem času se pri delu bolnikov ( do 20) pojavi plazmocitom.

MALIGNA MONOKLONSKA IMUNOGLOBULINEMIJA/GAMOPATIJA

Multipli mielom ( plazmocitom)
Klon tumorskih plazmatk najpogosteje izloča paraproteine razreda IgG, lahko tudi IgA, IgD, IgE ali lahke verige (Bence- Jonse-ov tip). Če gre za paraproteine lahkih verig, jih v plazmi ne zasledimo, ampak samo v urinu. Glavni klinični znak so osteolitične lezije kosti; tumorske celice namreč izločajo OAF ( osteoklast aktivirajoči faktor). To se kaže z bolečinami v kosteh, hiperkalciemijo, patološkimi frakturami. Ko se plazmatke razmnožujejo, pri tem izrivajo hemopoetsko tkivo, kar ima za posledico anemijo. Klinični znak je tudi ledvična insuficienca in amiloidoza. Pogoste so infekcije, ker je pospešena razgradnja normalnih Ig; to je najbolj izraženo pri paraproteinemiji razreda IgG, saj je razgradnja IgG eksponentno odvisna od njihove količine v plazmi.

Waldenströmova makroglobulinemija ( paraproteinemija IgM)

Značilno je pomnoževanje tumorskih plazmatk v kostnem mozgu in vranici. Paraproteini so razreda IgM→ zato tudi ime makroglobulinemija ( sinonim za IgM je makroglobulin, saj je sestavljen iz 5 podenot). Tu ne prihaja do osteolitičnih lezij kosti, hiperkalciemij in bolezni ledvic. Glavni klinični znak je sindrom hiperviskoznosti krvi. Prizadet je vid. Pomembna manifestacija so nevrološke motnje.

POSLEDICE PATOLOŠKIH PROTEINOV

• Sindrom hiperviskoznosti
Velika koncentracija beljakovin v serumu, najpogosteje IgM (makroglobulinov), lahko pogojuje pomembno povečanje viskoznosti, ki moti pretok krvi v kostnem mozgu, prstih, ledvicah ali očeh. Na očesnem ozadju so značilno razširjene venule in precej krvavitev. Bolnik je pogosto zmeden ali pa težave preidejo v težje motnje osrednjega živčevja. Razvijejo se tudi znaki odpovedi srca in perifernih krvnih žil.
• Krioglobulinemija
Podobna klinična slika nastane zaradi prisotnosti krioglobulina v krvi, ki se na mrazu obori in nato na toplem spet stopi. Včasih pogojujejo Raynaudov fenomen (na hladnem postanejo prsti rok bledi, nato cianotični in rdeči), in celo gangreno po izpostavitvi nizkim temperaturam. Večina klinično pomembnih krioproteinov so Ig in se delijo na enostavne , monoklonske in mešane, poliklonske.Poliklonski krioglobulini so kompleksi IgG-IgM, redkeje IgG-IgM-IgA.Mešano krioglobulinemijo najdemo pri vnetnih boleznih vezivnega tkiva (avtoimune bolezni).
• Bolezen hladnih aglutininov
Ig, ki povzročajo hemolizo po izpostavitvi mrazu, včasih najdemo pri infekcijah (npr.pri infektivni mononukleozi, atipični pneumoniji), pri makroglobulinemiji ali limfosarkomu. To so navadno Ig za antigene eritrocitov.
• Bence-Jonesova proteinurija
Bence-Jonesovi proteini so proste k in -lahke verige iz monomerov ali dimerov. Monomerne lahke verige se filtrirajo skozi glomerule, reabsorbirajo v proksimalnih tubulih ledvic, presežek pa se izloči z urinom. Ko gredo skozi distalne tubule in zbiralca se lahko monomeri povežejo v dimere in se začno kopičiti. Nastajajo cilindri, ki skupaj z detritusom propadlih tubulnih celic zamašujejo tubule. Zato lahko pride zaradi proteinurije lahkih verig do kronične ledvične odpovedi.
Bolezen se dokaže s testom koagulacije: pri segrevanju kislega urina na 40-60 se proteini obarjajo, a ponovno raztapljajo pri 90. Učinkovitejši metodi sta elektroforeza in imunoelektroforeza zgoščenega urina.

DISPROTEINEMIJE
Disproteinemija je stanje, pri katerem je porušeno razmerje med deleži posameznih frakcij plazemskih beljakovin (npr. znižanje koncentracije albuminov, povečanje ene ali več globulinskih frakcij), pri čemer celokupna koncentracija proteinov ostaja v mejah normalnega.

a) pri akutnih boleznih (srčni infarkt, po operacijah, akutne infekcije,
nekroza)
Sproži se citokinski odgovor na stres, pri čemer se sproščata IL-1 in IL-6, ki v jetrih stimulirata sintezo beljakovin akutne faze, katerih večina je v frakcijah globulinov 1 in 2 (1-antitripsin, CRP, 2-haptoglobin, fibrinogen, komplement, ceruloplazmin), zavirata pa sintezo albumina (pade delež frakcije albumina) in transferina.
b) pri kroničnih obolenjih (kasnejše faze akutnega vnetja, maligni tumor, alergijske bolezni, avtoimune bolezni, kronične infekcije, sistemske bolezni sklepov in veziva)
Poleg beljakovin akutne faze (povečani frakciji globulinov 1 in 2) se poveča tudi frakcija globulinov  (vdor antigenov), zmanjšana je frakcija albumina. V področju globulinov  se na denzitogramu opaža zaokrožen vrh na široki osnovi, ki dokazuje heterogenost globulinov  (poliklonska imunoglobulinemija).
c) disproteinemija pri jetrnih boleznih (ciroza jeter, kronični hepatitits)
Povečana je frakcija globulinov  (IgA, IgG, IgM zlitje frakcij ß in  v elektroforeznem diagramu). Vzrok za povečano frakcijo  bi lahko bil vdor antigenov iz črevesja, saj zaradi portokavalnih anastomoz, ki nastanejo pri cirozi jeter, teče kri mimo jeter. Zaradi zmanjšanja števila funkcionalnih hepatocitov se frakcija ß in frakcija albumina zmanjšata.

A-γ-globulinemija
Ločimo dedno (X-vezano) in starostno (pridobljeno) obolenje. Pri dedni obliki je odsotnost γ-globulinov skoraj popolna, odsotne so tudi plazmatke v bezgavkah, vranici in kostnem mozgu. V zgodnjem otroštvu je otrok zaščiten z materinimi protitelesi, kasneje pa trpi za ohromljeno imunsko obrambo, zato je dovzeten za mnoge okužbe(pljučnice, sepse, furunkuloze).

Nefrotski sindrom
Nastane zaradi prevelike prepustnosti glomerulofiltracijske bariere za beljakovine, kar vodi v proteinurijo in hipoproteinemijo. Vzroka sta vnetna ali toksična okvara glomerulov. Stanje se kompenzira z večjo sintezo in manjšo razgradnjo albumina v jetrih. Kljub temu kompenzacija ne zadostuje in elektroforetsko zato najdemo znižano frakcijo albumina v serumu. Zniža se frakcija globulina γ, ker je njegova kompenzacija lahko samo antigensko stimulirana. Kompenzatorno sta zvišani frakciji globulina α2 in β. V imunoelektroforetskem diagramu so znižane frakcije IgG, transferina in albumina.
Enteralna izguba beljakovin
V gastrointestinalnem (GIT) se neselektivno zveča prepustnost za beljakovine, zato se znižajo frakcije vseh plazemskih beljakovin. Če se beljakovine izgubljajo v zgornjem delu GIT-a, pride do hiperaminoacidurije in pojava aminokislin v fecesu. Vzroki enteralne izgube so vnetja, motnje v limfatičnem sistemu, limfatične fistule v GIT-u, višji venski tlak. Elektroforetogram je podoben kot pri nefrotskem sindromu; imunoelektroforetsko opazimo znižano frakcijo IgG, frakciji IgM in IgA manjkata.

IZPAD POSAMEZNEGA PROTEINA

Gre za patološko stanje pri katerem so posamezni proteini plazme prisotni v spremenjeni obliki ali sploh niso prisotni (oz. v zelo zmanjšanih količinah). Največkrat je genetsko pogojeno; gen, ki kodira določen protein, je mutiran ali pa manjka. Izpad določenega proteina (specifična aproteinemija) ima lahko hude posledice, lahko pa se pojavlja brez bolezenskih znakov. Če je količina manjkajočega proteina majhna, se razmerje med posameznimi frakcijami dejansko ne spremeni in torej ne govorimo o disproteinemiji.
Za diagnozo se običajno uporablja imunoelektroforeza, ki omogoča ločevanje večjega števila posameznih proteinov. Funkcionalno pomembne proteine pa dokažemo na podlagi biološke aktivnosti; če manjkajo, ustrezna aktivnost izostane (npr. faktorji strjevanja).

Odsotnost α1-antitripsina
Količina α1-antitripsina, fiziološko pomembnega inhibitorja proteaz, je zmanjšana na 10 normalne vrednosti. Mutacija povzroči spremembo konformacije molekule α1-antitripsina, ki sproži polimerizacijo teh molekul v fibrile v hepatocitih. To zmanjša izločanje α1antitripsina in padec njegove koncentracije ter posledično aktivnost proteaz v krvi in tkivih. Zaradi aktivnosti elastaze v pljučih prihaja do razgradnje vezivnega tkiva. Razvijajo se obstruktivne pljučne bolezni, predvsem juvenilni (mladostni) emfizem.

Odsotnost ceruloplazmina (Mb. Wilson)
Ceruloplazmin je najpomembnejši protein plazme za vezavi bakra. Njegova odsotnost ima za posledico hiter prehod bakra iz krvi v tkiva, kot tudi hitro izločanje preko ledvic. Resorpcija v črevesju se poveča in nastane pozitivna bilanca bakra, kljub povečanemu izločanju z urinom. Najbrž ne gre za motnjo v sintezi ceruloplazmina; motena je pretvorba neaktivne predstopnje v aktivni protein, ki veže baker.
Tkivno kopičenje bakra spodbuja nastajanje hidroksilnega radikala, ki povzroča poškodbe celičnih membran, proteinov in DNA. Pri kopičenju v možganih (nevrološka oblika, prizadeti so nevroni substantije nigre) se pojavljajo simptomi podobni Parkinsonovi bolezni (rigor, akinezija, hipersalivacija, hipo- oz. amimija, tremor, nekoordinirano gibanje). Kopičenje v jetrih (hepatična oblika) povzroča cirozo jeter.


IV. HITROST SEDIMENTACIJE ERITROCITOV

To je enostaven laboratorijski test, ki se pogosto uporablja v praksi in meri razdaljo v mm, ki jo prepotujejo oz. za katero padejo eritrociti v 1h. Vzorcu krvi dodamo antikoagulant(natrijev citrat), nato kri vsrkamo v cevko, ki jo postavimo navpično v stojalo in pustimo eno uro. Rezultat odčitamo tako, da izmerimo razdaljo od stebrička eritrocitov do vrha plazme. Hitrost sedimentacije eritrocitov je za ženske večja kot za moške, in sicer v povprečju do 25mm/uro, medtem ko ta vrednost za moške znaša do 16mm/uro. S starostjo te vrednosti naraščajo. Zgornjo mejo dobimo tako, da za moške leta starosti delimo z 2, za ženske pa tako, da letom starosti prištejemo 10 in nato delimo z 2.
Eritrociti in vitro sedimentirajo, ker je njihova gostota večja od gostote plazme.
Plazma je viskozna tekočina, zato padanju eritrocitov nasprotuje sila upora, ki je odvisna od hitrosti padanja eritrocitov, viskoznosti plazme in oblike eritrocitov(Stokesov zakon). Sili se izenačita in hitrost padanja postane konstantna(hitrost sedimentacije). Potrebna sila upora, ki uravnoteži silo težnosti, se pri delcih z bolj hidrodinamično obliko, doseže pri večji hitrosti.
Stopnja sedimentacije je odvisna od eritrocitnega zlepljanja(agregacije)in tvorbe stebričkov (rouleau). Normalno so eritrociti v plazmi ločeni zaradi negativnega naboja, ki ga imajo eritrociti na svoji površini in zaradi tega se med sabo odbijajo. Če se celice zlepijo in tvorijo stebričke, se njihova hitrost sedimentacije zaradi bolj hidrodinamične oblike poveča.
Zlepljanje eritrocitov povzročajo plazemske beljakovine, ki se vežejo nanje in nevtralizirajo negativni naboj na površini eritrocitov. Pri tem ima pomembno vlogo fibrinogen, polovico njegove moči pa imajo globulini α in γ, zato najbolj vplivajo na zvišano hitrost sedimentacije eritrocitov beljakovine akutne faze citokinskega nespecifičnega odgovora na stres.

UPORABA HITROSTI ERITROCITNE SEDIMENTACIJE V KLINIKI
Znižana hitrost sedimentacije nima diagnostičnega pomena, zvišana hitrost sedimentacije pa se uporablja za pridobitev 3 informacij: določitev prisotnosti ali odsotnosti bolezni, spremljanje razvoja bolezni in merjenje odgovora na terapijo.
Na zvišano hitrost sedimentacije eritrocitov vplivajo: spol(pri ženskah višje), starost(z leti narašča), nekatera zdravila in nosečnost. Zvišana hitrost pa je povezana tudi z nespecifičnim odgovorom na stres: nekrozo, vnetjem, vdorom mikroorganizmov. Ker je odgovor na stres nespecifičen, je zvišana hitrost sedimentacije nespecifičen pokazatelj bolezni; bolj nam kaže na resnost bolezni kot na to, za katero bolezen gre. Velika hitrost sedimentacije eritrocitov (>100mm/h) je zanesljiv neposredni znak bolezni.
Najpogostejše akutne in kronične bolezni, povezane z zvišano hitrostjo sedimentacije:
- INFEKCIJE(bolj pri bakterijskih kot virusnih)
- AVTOIMUNSKE SISTEMSKE BOLEZNI(bolezni veziva, sklepov, žil; npr. revmatoidni artritis, dermatomiozitis)
- MALIGNOMI V NAPREDOVALEM STADIJU(prisotne nekroze)
- VEČJE NEKROZE(npr.srčni infarkt, hematom)

















LITERATURA:

-Karlson&sod: Patobiochemie, Stuttgart 1982, str.360-372
-Siegenthaler et all: Klinische patophysiologie, Stuttgart, str.132-141
-Bedell, Bush (1985): Erythrocyte sedimentation rate, Am J Med 78: 1001-1009
-Gamulin S., Marušić M., Krvavica S. (Eds): Patofiziologija, Jumena, Zagreb, 1988; str.773-778