1) DEFINICIJA

a. Anemija (definicija in razdelitev)
Anemija nastane, kadar nadomeščanje zrelih eritrocitov iz hematopoetskih organov ne dohaja njihovega propadanja ali izgube (npr. ob krvavitvi). Anemijo v splošnem definiramo kot zmanjšano maso hemoglobina (Hb) oz. število eritrocitov v volumski enoti krvi. Ob tem se zmanjša oksidativna kapaciteta volumske enote krvi, ki pa sama še ni zadostni pogoj za anemijo. Pri dehidracijah oz. hiperhidracijah pride do trenutnega navideznega povečanja oz. zmanjšanja koncentracije Hb zaradi spremembe v količini vode.
Anemije so akutne in kronične, pri čemer slednje povzročajo blažje simptome, ker je že prišlo do odziva s kompenzatornimi mehanizmi (hemodinamične in biokemične adaptacije).
Anemije delimo glede na vzrok na:
• posthemoragične anemije,
• hemolitične anemije (motnje v membrani, citoskeletu ali proteinih eritrocita) in
• anemije zaradi nezadostne eritropoeze, kjer ločimo tri skupine: anemije zaradi okvare matičnih celic, anemije zaradi motenj v sintezi hema ter megaloblastne makrocitne anemije.
Simptomi anemij so odvisni od vzrokov, torej primarne bolezni, ki je povzročila anemijo.

b. Makrocitna anemija
Makrocitno anemijo definira povečano število velikih, ovalnih eritrocitov v periferni krvi. O makrocitni anemiji govorimo, ko je MCV (povprečen volumen eritrocita) večji od 100 fl. So posledica napak v eritropoezi in ločimo megaloblastne makrocitne ter nemegaloblastne makrocitne anemije.

c. Megaloblastna anemija
Megaloblastne anemije so posledice motene (upočasnjene) sinteze DNA, pri čemer pa sinteza RNA ni prizadeta. Tako se v času ene celične delitve volumen citoplazme močno poveča glede na jedro. To daje velike celice z normalnim razvojem citoplazme, a upočasnjeno delitvijo. Taka okvara najbolj opazno prizadane hitro deleče se celice npr. prekurzorske celice za eritrocite, trombocite in levkocite.


2) VRSTE MEGALOBLASTNIH ANEMIJ
Megaloblastne anemije so v glavnem posledice ali pomanjkanja kobalamina (vitamin B12) ali pomanjkanja folne kisline v telesu. Lahko so povod za nastanek megaloblastne anemije tudi zdravila, ki ovirajo sintezo DNA (aciklovir, pirimidinski in purinski antagonisti npr. 5-FU oz. zdravila za HIV – zidovudine) ali dedne nepravilnosti (Lesch-Nyhanov sindrom, dedna orotična acidurija, pomanjkanje transkobalamina II …).


3) PRESNOVA FOLATA
Folna kislina je splošno (bolj poznano) ime za pteroilmonoglutaminsko kislino, ki jo sintetizira veliko različnih rastlin in bakterij. Človek folne kisline ne more sintetizirati, zato jo mora nujno dobiti iz prehrane, predvsem zelene listnate zelenjave, sadja, jeter ali kvasa.
V hrani so folati večinoma konjugirani z verigo poliglutamatov. Posebni encimi, konjugaze, v ščetkastem obrobju intestinalnega epitelija odcepijo poliglutamatne stranske verige do monoglutamatov in diglutamatov, ki se nato lahko absorbirajo v proksimalnem jejunumu. V epitelijskih celicah jejunuma se folat takoj reducira do tetrahidrofolata. Ta redukcija, ki jo katalizira encim dihidrofolat reduktaza, poteče v dveh stopnjah:

1.
2.

V plazmi se folat prenaša večinoma v obliki monoglutamata, N5-metil-tetrahidrofolata, ki vstopa v celice preko specifičnega transporterja. V celicah encim metionin sintaza odcepi metilno skupino od N5-metil-tetrahidrofolata in jo prenese preko kobalamina na homocistein.
V reakciji sproščeni tetrahidrofolat se nato ponovno konjugira z verigo 4 ali 5 glutamatov. Konjugacija je pomembna za zadrževanje folata v celici.
Glavna funkcija folne kisline je prenos spojin z enim ogljikovim atomom (metilne, metilene, metenilne in formilne skupine). Možni donorji 1-C fragmentov so serin, glicin, formaldehid, histidin in format. Primarni vir 1-C fragmentov je serin (slika spodaj).


Tetrahidrofolati s pripetimi 1-C fragmenti predajajo 1-C fragmente ustreznim akceptorjem. (Slika levo.) Tako nastanejo intermediati metabolnih poti, vključenih v sintezo določenih bioloških makromolekul. Najpomembnejši gradniki makromolekul, katerih nastanek je odvisen od folne kisline, so purini (atoma C2 in C8), dTMP ter metionin.
V vseh reakcijah z izjemo timidilat sintazne reakcije se sprošča prosti tetrahidrofolat. Le-ta lahko takoj sprejme nov 1-C fragment in spet postane donor 1-C fragmenta. V timidilat sintazni reakciji pa se sprošča dihidrofolat, ki se mora najprej zreducirati do tetrahidrofolata preden lahko sprejme 1-C fragment. Redukcijo katalizira že omenjena dihidrofolat reduktaza.


Normalno imamo v telesu 5 do 20 mg zalog folne kisline, od tega polovico v jetrih. Ker minimalna dnevna poraba folata znaša 50 μg, pride do pomanjkanja folne kisline šele nekaj mesecev po močno zmanjšanem oz. prekinjenem vnosu. Normalna = 6 – 20 ng/mL, vrednosti 4 ng/mL kažejo na pomanjkanje folata.
Do pomanjkanja folne kisline lahko pride zaradi:
• nezadostnega privzema s hrano (pogosto pri alkoholikih, starejših ljudeh ter mladostnikih, ki jedo pretežno hitro hrano),
• povečanih potreb (nosečnost, rast telesa pri otrocih, bolniki s kronično hemolitično anemijo, bolniki na kronični hemodializi),
• malabsorpcije (posledica parazitskih okužb, celiakije, resekcije proksimalnega jejunuma, uživanja zdravil – fenitoina, primidona, fenobarbitala) in
• okvarjene presnove folata (povzročena ali z inhibitorji dihidrofolat reduktaze – metotreksat, pentamidin, trimetoprim, triamteren – ali s pomanjkanjem kobalamina ali uporabe oralnih kontraceptivov ali pa nasploh že prirojene genetske motnje, kjer pride do okvare encimov, udeleženih v folatnih metabolnih poteh).
Pomanjkanje folata povzroči megaloblastno makrocitno anemijo, ki jo pogosto tudi spremlja diareja. Nevroloških motenj pri odraslem človeku ni, pri razvijajočem se embriju pa pomanjkanje folne kisline v 4. tednu nosečnosti lahko povzroči defekte v zapiranju nevralne cevi – npr. spino bifido cystico.


4) PRESNOVA B12 ALI KOBALAMINA
Kobalamin je kompleks korinskega obroča (podoben porfirinskemu) in kobaltovega iona, ki je vezan na sredini. Človek ga ne more sam proizvajati, zato je nujen vnos s hrano (najmanj 2.5 µg/dan; s hrano dobimo 5-30 µg, v kri se ga absorbira 1-5 µg). Vir kobalamina je hrana mesnega in mlečnega izvora, tudi morski sadeži in ribe.
Med prebavo v želodcu se sprosti z beljakovin in tvori stabilen kompleks z želodčnim R-vezalnim proteinom. V dvanajstniku se ta kompleks prebavi in kobalamin se nato veže na intrinzični faktor (IF), ki ga sproščajo parietalne celice želodca. Ta kompleks je odporen na proteolitično razgradnjo, potuje do distalnega dela ileuma in se absorbira po vezavi na receptorje na ščetkastem obrobku mukoznih celic. Znotraj celice se IF uniči, kobalamin pa se veže na transkobalamin II (TCII). Kompleks gre nato v kri, od tam pa v jetra (2 mg), kostni mozeg in druge celice (2 mg). Kompleks kobalamin-TCII ima kratek razpolovni čas (1 h), zato ga najdemo v krvi večino vezanega na TCI (razpolovni čas nekaj dni).
Kobalamin ima 2 metabolično aktivni obliki: metilkobalamin in adenozilkobalamin. Terapevtsko se uporablja cianokobalamin - vitamin B12, ki pa se mora v telesu najprej spremeniti v biološko akitvno obliko. Metilkobalamin služi kot kofaktor za encim metionin sintazo, ki pretvarja homocistein v metionin. Pri tem dobi kobalamin metilno skupino od N5-metil-FH4, nastaneta pa FH4 (tetrahidrofolat) in metilkobalamin. Če kobalamina primanjkuje, ostane folat ujet v obliki N5-metil-FH4 (folatna past). To je edina reakcija v telesu, kjer metil-FH4 lahko odda metilno skupino in če do tega ne pride, bo prišlo do pomanjkanja aktivnega folata. Iz FH4 pod normalnimi pogoji namreč nastane N5N10-metilen-FH4, ki je koencim timidilat sintaze. Ta encim sodeluje pri nastanku dTMP iz dUMP. dUMP se kopiči in pomotoma vgrajuje v DNA; motnje se pojavijo pri sintezi in popravilu DNA ter pri sami celični delitvi. Rezultat je megaloblastna anemija. Hkrati se kopiči homocistein (zvečano tveganje za nastanek arterijske in venske tromboze) in primanjkuje metionin za produkcijo holina in holinskih fosfolipidov (nevrološke motnje).
Adenozilkobalamin sodeluje pri pretvorbi metilmalonila CoA v sukcinil CoA. Pomanjkanje vodi v kopičenje metilmalonila CoA in prekurzorja propionila CoA, zato pride do sinteze nefizioloških MK z lihim št. C atomov in njihove vgradnje v nevronske lipide (demielinizacija, propad živčnih vlaken).
Zaradi majhne dnevne porabe in velikih zalog v telesu, se pomanjkanje kobalamina pokaže šele čez 3-6 let. Normalni = 300 – 900 pg/mL, vrednosti < 200 pg/mL kažejo na pomanjkanje kobalamina. Za pomanjkanje so krivi različni vzroki:
• nezadosten vnos s hrano (redko - strogi vegetarijanci)
• oslabljena absorbcija (največkrat) zaradi aklorhidrije (pri starejših ljudeh, oslabljeno sproščanje HCl in kobalamin se težje loči od beljakovin v želodcu), perniciozne anemije (odsotnosti IF, lahko zaradi atrofije želodčne sluznice ali zaradi avtoimunega uničenja parietalnih celic-protitelesa proti parietalnim celicam ali IF, kar oslabi absorbcijo kobalamina), gastrektomije (izguba/uničenje parietalnih celic, ni več produkcije IF), prekomernost črevesnih bakterij in črevesni zajedalci (sindrom slepe zanke; prevzamejo kobalamin pred absorbcijo) anatomskih nepravilnosti prebavnega trakta (lezije, divertikule, anastomoze…), bolezni distalnega ileuma (regionalni enteritis, tropske bolezni, resekcija ileuma, tumorji…)
• NO (uničuje endogeni kobalamin), pomanjkanje TCII, podedovani encimski defekti, zdravila (omeprazol - zavira sproščanje HCl).


5) SPREMEMBE V KOSTNEM MOZGU IN KRVI PRI MAKROCITNIH MEGALOBLASTNIH ANEMIJAH

a) Presnova eritrocitov
Prenatalno se krvne celice razvijajo najprej v mezodermu rumenjakovega mehurčka, kasneje v vranici in jetrih, nato pa samo še v kostnem mozgu, ki je postnatalno tudi edino mesto hemopoeze. V procesu eritropoeze nastane dnevno 3• 109 eritrocitov na kilogram telesne teže. Pri tem je pomemben eritropoetin in rastni dejavniki. Skupaj s tvorbo drugih celičnih sestavin poteka med eritropoezo tudi tvorba hemoglobina (4 pirolovi obtoči + Fe2+ = hem + polipeptid = veriga, 2α + 2β verigi = hemoglobin). Ko se zreli eritrociti izplavijo v kri, krožijo po krvnem obtoku približno 120 dni, dokler ne začne njihova celična membrana postajati krhka. V rdeči pulpi vranice krhki in stari eritrociti razpadejo. Hemoglobin, ki ostane, fagocitirajo makrofagi (največ Kupfferjeve celice v jetrih), nato ta razpade na hem in globin. Železo iz hema spustijo nazaj v kri, od koder gre kot transferin v kostni mozeg za produkcijo novih eritrocitov, ali pa potuje v jetra, kjer se skladišči v obliki feritina. Iz pirolovih obročev nastane biliverdin, nato bilirubin, ki ga makrofagi spustijo v kri, kjer se veže na plazemski albumin. Ko pride do jeter, se konjugira z glukuronsko kislino in izstopi ž žolčem v črevo. Tam ga bakterije preoblikujejo v topen urobilinogen, ki se deloma resorbira nazaj v kri. Nekaj tega gre preko jeter nazaj v črevo, ostalo pa preko ledvic v urin, kjer se oksidra v urobilin. Neresorbiran urobilinogen pa se tudi oksidira in preoblikuje v sterkobilin in se izloči z blatom. Bilirubin nam kot žolčni pigment služi pri diagnosticiranju hemolitičnih krvnih bolezni in jetrnih bolezni.

b) Eritropoeza pri makrocitni anemiji in zdravi osebi, pomen eritropoetina
Eritropoeza poteka v kostnem mozgu, kjer se iz osnovne pluripotentne matične celice najprej razvije multipotentna mieloična celica. Ta je osnova za nadaljnji razvoj proeritroblasta. Iz njega se razvije bazofilni eritroblast, sledi polikromatični eritroblast, za njim pa ortokromatični eritroblast. Ko ta izgubi jedro, nastane retikulocit. Ta dozori v zreli eritrocit, ki se izloči v periferno kri. Tekom razvoja se velikost prekurzorjev manjša, kromatin se zgoščuje, citoplazma postaja vedno bolj eozinofilna.
Eritropoetin je glavni faktor, ki v stanju hipoksije stimulira nastanek proeritroblastov iz hemopoetskih matičnih celic in pospeši nadaljnjo eritropoezo. Ko se v krvi stvori dovolj eritrocitov za zadosten prenos O2 do tkiv, se količina eritropoetina zmanjša. Veliko večino (90) eritropoetina izločajo peritubularne intersticijske celice ledvic, ki zaznajo zmanjšano oksigenacijo tkiva. Izločanje naj bi pospešila tudi hipoksija v drugih delih telesa, pri čemer imajo veliko vlogo adrenalin, noradrenalin in nekateri prostaglandini.
Pri megaloblastni anemiji se prekurzorji eritrocitov v kostnem mozgu zaradi pomanjkanja timidilne kisline oz. DNA ne morejo tako hitro deliti, zato so nastajajoče celice patološko spremenjenih oblik. Jedro je slabše razvito (kromatin se fenestrirano kondenzira), citoplazme je veliko (saj se ta za razliko od jedra normalno razvija). Pred sproščanjem v kri 90 prekurzorjev propade (navadno jih propade 10-15), zato se razvije anemija hude stopnje. Zaradi neučinkovitosti eritropoeze se število proeritroblastov v kostnem mozgu pod vplivom eritropoetina močno poveča (hipercelularnost kostnega mozga), tako da se zmanjša razmerje med mieloidnimi in eritroidnimi prekurzorji. Moteno je tudi dozorevanje granulocitov in magakariocitov.

c) Spremembe v krvi
Značilne so spremembe krvnih celic in spremembe v koncentraciji nekaterih snovi v plazmi. MCV (srednji volumen eritrocitov) se poveča nad 110 fL, izrazita je makroovalocitoza – povečani eritrociti ovalne oblike z veliko hemoglobina z značilnimi vključki, ki včasih obdržijo jedro. Ostanke jedra imenujemo Howell-Jollyeva telesca. Prisotni sta tudi anizocitoza – razlike v velikosti eritrocitov in poikilocitoza- razlike v obliki eritrocitov. Število levkocitov je zmanjšano - levkocitopenija, nevtrofilci so hipersegmentirani, metamielociti povečani. Prisotni sta še retikulocitopenija in trombocitopenija, pri trombocitih pa najdemo še patološke razlike v velikosti in obliki.

Slika: makroovalocitoza Slika: Anizocitoza Slika: Poikilocitoza Slika: Hipersegmentiran nevtrofilec

Serumska koncentracija kobalamina, manjša od 200 pg/mL, vodi do povečane koncentracije metilmalonilne kisline in homocisteina, katerega vrednost je povečana tudi pri padcu koncentracije folata pod 4 ng/mL. Zaradi nepravilne eritropoeze se večina eritrocitnih prekurzorjev uniči, preden se iz kostnega mozga izločijo v kri. To povzroči povečanje koncentracije nekonjugiranega bilirubina in laktatne dehidrogenaze v plazmi. Moten metabolizem purinskih nukleotidov vodi do nabiranja sečne kisline. Pozitivna bilanca železa zaradi povečanega sproščanja železa iz hemoglobina in zmanjšane tvorbe hema pa povzroči plazemski porast feritina (na beljakovino vezanega železa).

d) Motnje presnove pri megaloblastnih anemijah, ki ne prizadenejo eritropoeze
Poleg hematoloških motenj se pri megaloblastnih anemijah pojavijo tudi motnje gastrointestinalnega trakta in živčevja. Med gastrointestinalne simptome štejemo otečen, gladek, živo rdeč jezik in prebavne motnje (anoreksijo, ki jo včasih spremlja diareja). Vzrok simptomov je neučinkovitost epitelijske bariere (vnetje), saj se zaradi pomanjkanja timina epitelijske celice ne morejo dovolj hitro obnavljati.
Nevrološke motnje: Zaradi pomanjkanja B12 pride do zmanjšane sinteze metionina, ki je donor metilne skupine v reakcijah nastanka holina in holin-vsebujočih fosfolipidov. Poveča se tudi količina metilmalonil CoA oz. njegovega prekurzorja propionil CoA, kar vodi do nefiziološkega vključevanja lihoštevilnih maščobnih kislin. Posledica so demielinizacija, ki ji sledi aksonska degeneracija ter končno smrt nevrona. Okvare vključujejo periferne živce, hrbtenjačo in možgane. Degeneracija se kaže kot odrevenelost in parestezija udov, šibkost, ataksija, motnje v delovanju sfinktrov, moteni so refleksi, zmanjšana je občutljivost čutil za položaj in vibracije. Pojavijo se tudi psihološki znaki, razdražljivost, pozabljivost, demenca in psihoza.
Vse te hematološke in nehematološke spremembe nastopajo pri posamezniku v različnih kombinacijah (npr. le hematološke spremembe ali le nevrološke in gastrointestinalne spremembe brez hematoloških, ipd.) in le redko so pri posameznem bolniku prisotne spremembe na vseh področjih.


6) POMEN LOČEVANJA ANEMIJE ZARADI POMANKANJA B12 OD ANEMIJE ZARADI POMANKANJA FOLATA
Pomanjkanje B12 povzroči kopičenje tetrahidrofolata v metilni obliki, saj se metilna skupina ne more prenesti na kobalamin (za reakcijo nastajanja metionina iz homocisteina). Metil-THF se tudi ne more oksidirati v druge oblike, tako da ne obstaja v poliglutamatni obliki in se izloča iz celice.
Obe anemiji, posledici B12 ali folatne nezadostnosti, imata torej enak mehanizem nastanka (pomanjkanje folata). Problem je v tem, da ima kobalaminska insuficienca poleg napak hitrodelečih celic (krvne celice, črevesna sluznica,...) še nevrološke komplikacije (demielinizacija). Zdravljenje B12 pomanjkljivega pacienta s folatno terapijo prehodno izboljša krvno sliko, ne vpliva pa na demielinizacijo, oziroma jo lahko še poslabša. Zato je nujno točno vedeti, za katero od anemij dejansko gre, in jo pravilno zdraviti.
Načini za ločevanje pomanjkanje B12 in folata: merjenje serumskega folata (normalno: 6–20 ng/mL) in kobalamina (normalno: 300-900 pg/mL), merjenje krvnega metilmalonila in homocisteina (oba sta povišana pri pomanjkanju kobalamina, pri folatni insuficienci pa je zvišan le homocistein).


7) SCHILLINGOV TEST
Ko vemo, da gre pri pacientu za kobalaminsko insuficienco, izvedemo Schillingov test, metodo za ugotavljanje patogeneze pomanjkanja.
Peroralno administriramo radioaktiven kobalamin, kmalu nato pa vnesemo parenteralno še neoznačen vitamin, nakar merimo izločanje radioaktivnega kobalamina z urinom skozi naslednjih 24 ur. Ker je pri večini nezadostnosti razlog malabsorbcija, je pri obolelih izločena količina ponavadi abnormalno znižana (normalno se ga izloči 8-40), saj se z urinom izloča le kobalamin, prisoten v krvi. Nato ponovimo test, le da je sedaj označen kobalamin vezan na intrinzični faktor. Če je razlog insuficience perniciozna anemija ali kaka druga okvara IF, se bo izločanje radioaktivnega kobalamina v urinu dvignilo proti normalni ravni. Če je klirens še zmeraj prenizek, so za malabsorbcijo navadno odgovorne bakterijske okužbe ali pa okvare ileuma (vključno z okvaro ileuma, ki je nastala sekundarno, zaradi primarne napake kobalaminskega pomankanja).