UVOD

Telomere so deli DNA na koncih kromosomov, ki služijo kot zaščitne kapice, omogočajo njihovo podvajanje in so kot nekakšna biološka ura. Pri vsaki delitvi navadnih celic se izgubi del telomer. Čez čas, ko teh telomer zmanjka, se celica ne more več deliti in vstopi v celično apoptozo. Tako imajo normalne somatske celice omejeno podvojevalno obdobje, ki traja približno petdeset delitev. Rakave in tumorske celice pa imajo veliko količino encima telomeraza, ki podaljšuje telomere in jih nikoli ne zmanjka. Zato jim rečemo nesmrtne celice. Znanstveniki si prizadevajo, da bi aktivirali produkcijo telomeraze v navadnih celicah, kar bi podaljšalo življenje in preprečevalo bolezni, ki so povezane s staranjem ter inhibirali telomerazo v rakavih celicah, kar bi povzročilo njihovo apoptozo.

Določeni oligonukleotidi in ribocimi so sposobni inhibirati telomerazo na 2 načina:
a) tarče so telomerazne mRNA
b) tarče so RNA komponente v telomerazah
Telomerazo pa lahko inhibirajo tudi male molekule, ki nanjo delujejo kot katalitični inhibitorji.
V praksi pa se ti načini zdravljenja ne obnesejo najbolje, ker imajo zakasnel učinek.
Zdravila, ki se direktno vežejo na telomere in stabilizirajo DNA strukture kot so G-kvadrupleksi (G4), so tudi inhibitorji telomeraze in zmotijo telomerno zgradbo. Ta zdravila bi lahko v kombinaciji z bolj citotoksičnimi agensi dala hitrejše odzive v rakavih celicah, ki so manj odvisne od dolžine telomer.


TELOMERE

Zgradba telomerne DNA

Telomere so nukleoproteinske strukture na koncih linearnih kromosomov. Večina je zgrajena iz kratkih, enostavnih ponvljajočih se oligonukleotidnih zaporedij. Telomere sesalcev imajo 5 do 25 kilobaznih ponovitev šestnukleotidniga zaporedja TTAGGG v smeri 5`-3` proti koncu kromosoma. To pomeni, da so bogata z gvaninom (G-nukleotidi) na tisti strani dvojne vijačnice, ki je 3`-konec kromosoma. Nasprotna stran vijačnice (5`-konec) pa je bogata s citozinom (C-nukleotidi). C-bogata veriga je nekoliko krajša od G-bogate, zaradi česar nastane enoverižni 3`-previs. Telomere se ne končajo linearno, ampak tvorijo zankaste strukture (T-loop) z 3` G-bogatimi in 5` C-bogatimi verigami, tako da tvori Hollidayevo križiščno strukturo. Formacijo in vzdrževanje T-loop strukture pa olajšujejo proteini, ki se na koncu vsakega kromosoma vežejo na DNA.






Prostor za skico




Diagram T-loop strukture v kateri 3` G-bogati previs in del C-bogate verige tvorijo Hollidayevo križiščno strukturo.

Telomere so visoko ohranjene strukture, saj jih najdemo v enoceličnih evkariontih, pa vse do sesalcev. To nakazuje na njihovo varovalno vlogo v preprečevnju degradacije kromosomskih koncev in njihovega medsebojnega povezovanja. Brez telomernih kapic bi se človeški kromosomi združili in tvorili multicentrične kromosome. Ti bi se med mitozo lomili, posledice pa bi bile hude genomske poškodbe, ki vodijo v celično senescenco ali apoptozo.


TELOMERAZE

Običajne polimeraze DNA ne morejo sintetizirati G-bogate 3`previse, zato je za ohranjanje telomerne dolžine potreben encim telomeraza.
Telomeraze so ribonukleoproteinski kompleksi, ki dodajajo nukleotide na koncih kromosomov. Sestavljena je iz proteinske in RNA komponente. Proteinska komponenta ima nase vezano RNA komponento. Del RNA komponente je izpostavljen in ga imenujemo matrica, na njem se vrši reverzna transkripcija. Proteinski del ima vsaj tri funkcije. Vezavo RNA, vezavo DNA in katalizacijo podaljševanja oz. translokacijskega procesa.

Telomerazni reakcijski cikel

Med telomernim podaljševanjem se telomerni 3`-previs DNA molekule preko nukleotidnih baz poveže z RNA regijo telomeraze. Nato se lahko začne reverzna transkripcija, za katero se večkrat znova uporabi le določena kratka sekvenca nukleotidov telomerazne RNA komponente. Ta sekvenca pa je komplementarna telomerni sekvenci na kromosomih. V vsakem transkripcijskem ciklu se doda ena telomerna ponovitev. 5`-konec matrične verige je pozicija kjer se telomerni substrat najverjetneje, ali disociira, ali pa translocira na začetni konec matrice in cikel dodajanja nukleotidov se ponavlja dokler telomeraza in DNA vijačnica ne disociirata.

Mehanizem translokacije

Matrica se bere v smeri 3`-5` in ko pride prepis do 5`-konca matrice se telomerna regija DNA verige spet prestavi na 3`-začetek matrice. To reakcijo imenujemo translokacija.
Translokacija vključuje razdrtje beznih parov v DNA-RNA hibridu, repozicijo aktivnega mesta RNA matrice in ponovne vzpostavitve DNA-RNA interakcije na drugem koncu matrice. Ni točno znano koliko baznih parov mora ostati povezanih, da pride do translokacije. Za disociacijo pa predvidevajo,da je lahko največ 8-10 baznih parov razdrtih.
Predvidevajo, da nastajanje G-G zank oz. G-kvadrupleksov (G4) v nastajajoči telomeri, znižuje aktivacijsko energijo za translokacijo.

Multimerizacija človeške telomerazne reverzne transkriptaze (hTERT)

Človeške telomeraze tvorijo višje urejene dimere in vsaki telomerazni kompleks vsebuje dve RNA molekuli. Telomerazni RNA matrici sta v aktivnem encimu soodvisni in funkcionalno sodelujeta ena z drugo.

Predvidevajo tri modele kako telomerazne RNA matrice sodelujejo med seboj:
1 Izmenjavanje matric
Dve telomerazni matrici se za reverzno transkripcijo uporabljata izmenično.
2 Sidriščno mesto
Ena matrica stabilizira interakcijo s telomero, medtem ko se druga matrica uporablja za
reverzno transkripcijo.
3 Paralelno podvojevanje
Dva kromosomska konca se podaljšujeta sinhrono. Tako se lahko vodilna in zostajajoča
veriga podalšjujeta hkrati.

Asimetrija kromosomskih koncev

Replikacija telomer tvori dve različni hčerinski molekuli. Vodilna veriga telomere nastane z neprekinjeno sintezo G-bogate verige v 5`- 3` smeri proti koncu kromosoma. Tako podeduje C-bogate verige z 5`-koncem od starševske molekule. Zaostajajoča veriga telomere, ki se sintetizira diskontinuirano, pa vsebuje G-bogato starševsko verigo. Po principu semikonzervetivne DNA replikacije bi pričakovali, da ima vodilna veriga telomere top konec, zaostajajoča veriga pa 3`-previs. Vendar pa so dokazali, da imata v S-fazi celičnega cikla obe verigi 3`-previs.

Krajšanje in podaljševanje telomer

Posledica telomerazne neaktivnosti je krajšanje telomer.Sinteza vodilne verige se konča prehitro, ker nima templeta (template) za sintezo 3 previsa. Hitrost krajšanja naj bi torej bila premosorazmerna z dolžino 3 previsa. Do tega pa ne pride, ker je telomeraza sposobna dodajati telomerna ponavljajoča se zaporedja na 3 konec na novo sintetizirane vodilne verige.

Telomeraza je aktivna v pozni S fazi, takrat pa tudi poteka replikacija DNA, ko se podvajajo telomerne regije. Do fizične interakcije med primazo in telomerazo ne pride. Njuno delovanje uravnava protein Cdc13p (single-strand DNA-binding protein) se veže na DNA polimerazo α in nato interagira s proteinom Est1. Razvili so dve razlagi, kako oba proteina delujeta in vplivata na telomerazo:

Model zbiranja
Na telomero vezan Cdc13p deluje na Est 1 v pozni S fazi, ta pa nato še na preostale dele telomeraze.

Model aktivacije
Telomeraza je vezana na telomero, a je neaktivna vse do pozne S faze, ko se Est1 poveže z njo in jo potem, ko se poveže z cdc13p, aktivira.


TELOMERE IN TELOMERAZE KOT TARČE ZA ZDRAVILA

Telomere preprečujejo združevanje kromosomov, druga njihova bistvena naloga pa je preprečevanje izgube oz. odcepljanja posameznih nukleotidov iz kateregakoli konca kromosoma.

Do izgube nukleotidnih parov lahko pride zaradi dveh razlogov:
1) problem replikacijskega konca
Do tega pride, ker je mehanizem podvojevanja DNA zastavljen tako, da ne more podvojiti
zadnjih nekaj parov zaostajajoče verige med sintezo DNA.
2) eksonukleaze
Eksonukleaze delujejo v 5  3 smeri in redčijo CA sekvence telomere

Telomerne sekvence so za celico nepomembne. Obstajajo zato, ker se genom ob vsaki celični delitvi krajša in ne bi bilo dobro, da bi se krajšal na račun genov, ki kodirajo proteine.

V rakastih celicah, kjer so telomeraze aktivne, so le-te dobra tarča za protirakava zdravila.

Kontrola sinteze in združevanja elementov pomembnih za telomerazno delovanje

Človeški telomerazni encim sestoji iz več podenot:
1) katalitična podenota humana telomeraza reverzna transkriptaza – hTERT
2) humana telomeraza RNA templet – hTR
3) proteini Hsp90, p23, TEP-1
Katerakoli zgoraj našteta komponenta ali protein je nujno potreben za delovanje telomeraze in kot taki so dobra tarča za zdravila kot so določeni oligonukleotidi, ribocimi in male molekule.

Hsp 90 in p23
Sta šaperona in nujno potrebna ta oblikovanje telomeraznega kompleksa.
Inhibitor Hsp 90 je geldanamicin.

mRNA za hTERT
- Oligonukleotidi, ki so komplementarni mRNA sekvenci, lahko z njo tvorijo hibride
- Ribocimi so prav tako sposobni zavreti ekspresijo mRNA. So male katalitične RNA molekule, ki so iz katalitične osnove, na kateri so sekvence, ki prepoznajo mRNA. Te RNA so endoribonukleaze, ki povzročijo degradacijo mRNA.

hTERT
Izražanje hTERT je zelo regulirana. Našli so kar nekaj transkripcijskih faktorjev, ki regulirajo ekspresijo genov za hTERT. Eden takih genov je c-MYC, ki inducira aktivnost telomeraze tako, da poveča transkripcijo mRNA za hTERT. Torej je naš cilj nekako onesposobiti ekspresijo tega gena. Našli so specifične G-kvadrupleksne strukture, ki delujejo na promoter c-MYC in onesposobijo ekspresijo gena.


Elementi, ki so pomembni za telomerazno dejavnost, kot tarča za zdravila

Določene sintetične molekule, ki se vežejo na komponento(e) telomeraznega kompleksa, imajo funkcijo on/off stikala. Nas zanimajo predvsem tiste, ki izključijo telomeraze, pa čeprav so v danem trenutku najbolj dejavne. Taka je ponavadi situacija v rakavih celicah. Dandanašnji poznamo le take, ki inhibirajo hTERT in hTR.
Modificirane RNA ali DNA molekule se lahko vežejo na RNA templet v hTR podenoti. Delujejo kot kompetativni inhibitorji in preprečujejo transkripcijo. Afiniteto (in posledično specifičnost) teh molekul za RNA templet v hTR lahko povečamo z raznoraznimi sladkornimi fosfodiesterskimi modifikcijami. Take modifikacije lahko tudi olajšajo vstop v celice – pomembno, ker zunaj nam namreč bore malo pomagajo.