Cilj genske terapije je zdravljenje podedovanih in pridobljenih genskih bolezni z vnosom genetskega materiala v celice. Osnovni princip je, da se namesto poškodovanega gena v izbrane celice vnese zdrav gen. Eden primernejših organov za vnos tujega dednega materiala so jetra, ker imajo hepatociti veliko sposobnost sinteze proteinov in tudi inducirajo posttranslacijske modifikacije. S pomočjo jeter bi se tako lahko zdravile tudi bolezni, ki z jetri sploh nimajo zveze.

Pri izražanju rekombinantnega gena je potrebno:
- da se zagotovi integracija v točno določeno, tarčno celično populacijo;
- da zagotovimo integracijo vnesene DNA na lokus, na katerem ne bo povzročila okvare drugega gena (izognitev t.i. insercijskim mutagenom);
- da se dosežejo fiziološke koncentracije produkta;
- da se izognemo imunološki inkompatibilnosti produkta;
- da na rekombinantnem genu vgradimo lastne kontrolne mehanizme izražanja (promotor,…), pokazalo se je namreč tudi to, da če rekombinirani gen ne vsebuje intronov, ne dosežemo fizioloških koncentracij produkta.

Za vnos genov v organizem obstajajo trije pristopi:
-ex vivo: celice se vzamejo iz organizma in gojijo v kulturi. Tam se jim tudi vnesejo novi geni, nakar se celice vrne v organizem.

-in vivo: genetski material se vbrizga v kri, nakar se cilja v tarčno tkivo.

-in situ: vektor z želenim genom se vnese direktno v tarčno tkivo.


Vektorji za vnos genov

Virusni vektorji so najpogostejši način vnosa genetskega materiala. Virusi morajo biti tako spremenjeni, da se ne razmnožujejo in da ne povzročajo bolezni.
• Retrovirus: to so RNA virusi, ki se lahko vgradijo v človeški genom. Ponavadi se za gensko terapijo uporablja MuLV virus (murine leukaemia virus – glodalci), ki lahko sprejme fragmente DNA velikosti do 8 kb. Ker je receptor za ta virus na številnih celicah, se ta virus uporablja v ex vivo pristopu. Za vgradnjo DNA se morajo celice deliti.
Problem tega načina je v tem, da lahko virus s svojo vgradnjo aktivira kak protoonkogen oz. onemogoči delovanje kakega drugega gena.
• Adenovirus: to so virusi, ki povzročajo okužbe zgornjih dihal. V njegov genom se lahko vključi DNA velikosti do 7,5 kb. Ti virusi se lahko pripravijo v velikih količinah in okužijo tudi celice, ki se ne delijo. Ekspresija takih genov pa je le prehodna, ker se ne vgradijo v celično DNA. Ko imunski sistem prepozna in uniči okužene celice, je konec tudi z ekspresijo. Delajo se tudi že virusi brez antigenskih značilnosti.
• AAV (adeno associated virus): je nepatogeni virus, ki vsebuje enoverižno DNA. Ob pomoči adenovirusa ali herpes simplex virusa se je sposoben vgraditi v kromosom 19 kot provirus. Vgradi se v celice, ki se delijo in v tiste, ki se ne. S svojo vgradnjo ne zmoti celičnih procesov. Ti virusi imajo relativno malo kapaciteto za tujo DNA – 4,7 kb.
• SV-40 (simian virus): za rekombinantne namene se tem virusom odstrani tipičen antigen. Virus nato z endocitozo vstopi v celico, nakar se njegova DNA naključno vgradi v celično. Vstopi v celice, ki se delijo in v tiste, ki se ne in to povsod po telesu. Kot pri retrovirusih obstaja tudi tu možnost aktivacije protoonkogenov.
• Lentivirus in hibridi herpes simplex virusa: Lentivirusi so vrsta retrovirusov, za katere je značilno, da trajno okužijo več vrst celic. Za gensko terapijo se uporablja »predelan« virus HIV.
Hibridi herpes simplex virusa so sestavljeni iz nepatogenega herpes simplex virusa in komponent AAV. Oba pristopa povzročita dolgotrajno ekspresijo.

Retrovirus Adenovirus AAV SV-40 Liposom
Velikost tuje DNA (kb) 8 7,5 4,7 5,2 poljubno
Trajanje ekspresije trajna prehodna trajna trajna prehodna
Tarčna tkiva Številna Epiteliji, jetra, živčno tkivo Jetra, možgani, skeletne mišice, krvne celice Jetra, pljuča, vranica, koža številna
Slabe strani Celice se morajo deliti Potrebna je ponovna aplikacija Majhna kapaciteta Majhna kapaciteta Potrebna je ponovna aplikacija
Tveganja Mutageneza Vnetni odziv Onkogenski potencial


Nevirusni vektorji: kljub prevladi virusnih vektorjev se vse bolj razvijajo nevirusni vektorji.
• Liposomi: za vnos genov se uporabljajo liposomi iz kationskih lipidov, ki vsebujejo plazmidno DNA (lipopleksi). Ti se enostavno pripravijo, lahko nosijo poljubno velike fragmente DNA in ne povzročijo imunskega odziva. Po drugi strani pa se ti lipopleksi v jetrih združijo s Kupfferjevimi celicami, kjer se DNA razgradi. Zato je potrebno liposomom spremeniti kemične in fizikalne lastnosti, da se usmerijo v jetrne celice. Kot uspešni so se izkazali liposomi, ki so bili manjši od 100 nm in označeni z azialofetuinom ali fosfatidil serinom. Anionski liposomi se tudi usmerijo k hepatocitom, kamor vstopijo s pinocitozo.
Disulfidna vez v liposomu poveča sproščanje DNA v citosol, jedrni proteini v liposomu pa pospešijo transport DNA v jedro.
• Polipleksi (sintetični virusi): sestavljeni so iz poli L-lizina, ki veže DNA in iz liganda, ki se veže z receptorjem na tarčnih celicah. Učinek teh vektorjev je majhen zaradi razgradnje kompleksa v endosomih.
• Hilomikronski ostanki: Hilomikroni so lipoproteini, ki po krvi prenašajo lipide in holesterol. Po hidrolizi z lipoproteinsko lipazo in vgradnjo apolipoproteinov nastanejo hilomikronski ostanki. Ti se vežejo na hepatocite. Za vnos DNA v jetra se dedni material veže na kationske lipide, ti pa se nato vstavijo v hilomikronske ostanke. Raziskave na živalih so pokazale visok nivo ekspresije tujih genov.
• Gola DNA: je ena najbolj enostavnih metod. Gola DNA se vbrizga v tarčne celice. Povzroči visok nivo ekspresije vbrizganih genov, vendar le v tistih celicah, ki jim je bila DNA vbrizgana.
• Elektroporacija: Pri tej tehniki so tarčne celice vzete iz organizma in izpostavljene visokonapetostnim šokom, ki naredijo membrano prepustno za DNA. Nato se celice vbrizgajo nazaj v organizem. Pri tej metodi se DNA vnese v celice, ekspresija genov pa je minimalna.
• RNA/DNA oligonukleotidi: uporabljajo se za popravljanje mutacij, ki prizadenejo en nukleotid. Oligonukleotid je komplementaren s sekvencami tarčnega gena, razen z napačnim nukleotidom. Tako lahko popravljalni mehanizmi prepoznajo okvaro in jo popravijo.
• Encim /neaktivno zdravilo: je pristop k zdravljenju rakavih bolezni. Gen, ki kodira nek encim, se z vektorjem vnese samo v rakave celice. Tam se začne izdelovati encim. V organizem se nato vbrizga neškodljiva oblika zdravila, ki jo ta encim pretvori v citotoksično.

Primeri bolezni, ki se zdravijo z gensko terapijo:

Jetrni rak. Ena metoda temelji na vnosu gena za nek encim, ki je sposoben pretvoriti neaktivno obliko zdravila v aktivno. Drug način je vnos gena za tumor nekrotični faktor (TNF-), kar sproži imunski odziv.

Virusni hepatitis. Hepatitis B in C se lahko jemlje kot pridobljena genetska bolezen. Obstajajo trije pristopi k zdravljenju:
 Vnos komplementarnih sekvenc za RNA povzroči nastanek RNA-DNA ali RNA-RNA hibridov, zaradi česar ne more priti do translacije RNA v protein.
 Ker poteka vgradnja virusne DNA v genomsko preko RNA intermediata, se lahko uporabijo ribocimi (kratke molekule RNA z endoribonukleazno aktivnostjo), ki to RNA razgradijo.
 Trajna virusna infekcija zmanjša imunski odziv, zato se razvijajo metode za okrepitev tega odziva. Eden od načinov je vnos virusnih genov v mišične celice, kar povzroči večje število virusnih peptidov v MHC molekulah.

Hemofilija B. Ta vrsta hemofilije je posledica pomanjkanja faktorja IX. Poskusi zdravljenja so bili opravljeni z vnašanjem gena za faktor IX v jetra.

Družinska hiperholesterolemija. Ta bolezen nastane zaradi napake v genu za LDL receptor, kar vodi v povišano koncentracijo LDL v krvi. Poskus genskega zdravljenja je bil opravljen z ex vivo načinom vnosa gena za LDL v jetrne celice.

Fenilketonurija. To je napaka v metabolizmu zaradi manjše aktivnosti ali pa odsotnosti fenilalanin hidroksilaze (PAH). In vitro poskusi z retrovirusom in kompleksom DNA/protein so pokazali visok nivo rekombinacije, in vivo pa je poskus spodletel. Nasprotno je adenovirusni vektor s PAH genom povzročil občutno znižanje serumske koncentracije fenilalanina, vendar le začasno.

Zaključek

Za vnos genov v človeško telo se je razvilo veliko pristopov. Številni in vitro in predklinični poskusi so že dali spodbudne rezultate, stabilna in dolgotrajna ekspresija in vivo pa še ni bila dosežena. Glavni izziv genske terapije je specifičen in učinkovit način vnosa genov v organizem. Raziskujejo se virusni in nevirusni vektorji, idealen način pa še ni bil odkrit. Ko bodo enkrat ti problemi premagani, bo genska terapija obetaven način zdravljenja številnih bolezni.