UVOD
Ime citokromi P450 predstavlja družino hemskih proteinov, s specifičnimi spektralnimi lastnostmi, ki so prisotni v vseh sesalskih celicah, razen v eritrocitih in prečnoprogastih mišičnih celicah, ki katalizirajo oksidacijo velikega števila strukturno zelo različnih spojin. Te spojine – substrati so lahko endogenega izvora (npr.steroidi, maščobne kisline) ali pa eksogenega izvora, kot so zdravila in aditivi iz hrane.
V medicini se kaže njihov velik pomen. Njihovo delovanje sega na več področij, to je aktivacija ali deaktivacija terapevtskih sredstev, pretvarjanje spojin v zelo reaktivne molekule, ki poškodujejo celice, povzročajo mutacije in celično smrt (kar ni zaželjeno), producirajo steroidne hormone in metabolizirajo maščobne kisline in njihove derivate.
Slika 1: Struktura citokroma P450
I. SPEKTRALNE LASTNOSTI
Proteine so določali za citokrome P450, še preden so poznali njihovo katalitično funkcijo, in sicer na podlagi njihovega značilnega absorpcijskega spektra. V raztopino veziklov endoplazemskega retikuluma, ki jim pravimo tudi mikrosomi, so dodali reducent (natrijev ditionit – Na2O4S2), ki je pretvoril hemsko železo iz Fe3+ v Fe2+ , da se je nanj lahko vezal ogljikov monoksid, ki so ga vpihavali v raztopino. Ta kompleks citokroma P450 in CO pa ima absorpcijski maksimum značilno pri 450 nm. Od tod tudi ime: P za pigment in 450 valovna dolžina vrha absorbnosti.
Specifične oblike citikromov P450 imajo vrednosti teh valovnih dolžin med 446 in 452 nm.

Slika 2: Spektrogram citokroma P450 z vezanim CO
II. NOMENKLATURA
Delitev, ki se uporablja za citokrome P450, se nanaša na njihove podobnosti sekvenc, v genske poddružine. Imena citokromov P450 so zapisana tako: CYP1A2, kjer CYP pomeni citokrom P450, prva številka označuje družino, črka poddružino in druga številka potem točno določi za kateri citokrom gre. Člani iste družine imajo skupnih 40 aminokislinskih zaporedij, člani iste poddružine pa imajo 55 homolognih sekvenc.

III. SPLOŠNA REAKCIJA
NADPH + H+ + O2 + SH  NADP+ + H2O + SOH
S v reakciji predstavlja substrat, ki je lahko maščobna kislina, zdravilo, alkan, alken, spojine, ki vsebujejo aromatski ali heterociklični obroč s substituento, ki je sposobna oksigenacije oz. bolj natančno monooksigenacije, zato tudi encim uvrščamo med monooksigenaze.
Citokromi P450 služijo kot končni receptorji elektronov v endoplazemskem retikulumu ali v notranji mitohondrijski membrani. Vsak citokrom P450 vsebuje eno samo prostetično skupino – protoporfirin IX, ki veže kisik in nastali hem lahko veže substrat.
Hemsko železo je vezano na štiri dušike porfirinskih obročev in na dva osna liganda, od katerih je eden SH skupina cisteinovega ostanka na karboksilnem koncu molekule.
Ko citokrom P450 veže substrat, pride do spremembe v strukturi okrog hema, ki ima za posledico povišan redukcijski potencial, tako da se lahko železo hitreje reducira z elektronom, ki ga prispeva NADPH preko flavoproteinskega encima NADPH-citokrom P450 reduktaze. Slika 3: Hemska struktura
Do hidroksilacije oz. monooksigenacije lahko pride samo, če je hem reduciran v Fe2+ , ker se samo v tem stanju nanj lahko veže molekula kisika. Ko se veže, zaradi svoje elektronegativnostipotegne k sebi elektron, ki je reduciral železo (O2- ). Nato pride še drugi elektron iz NADPH , zaradi katerega se razcepi molekula kisika. Za monooksigenacijo sta potrebna dva elektrona, prvi za redukcijo železa, drugi za cepitev molekule kisika in se prenašata posamično.
Slika 4: Reakcijski cikel

IV. MULTIPLE OBLIKE CITOKROMOV P450
Multiple oblike citokromov P450 so nastale kot posledica podvajanj genov v zadnjih 5-50 milijonih let in se med posameznimi vrstami razlikujejo, ker so bili podvrženi različnim selekcijskim pritiskom okolja. Prvotni citokromi P450 so katalizirali endogene substrate. Predvidevajo, da so bili najzgodnejši tisti, ki so metabolizirali holesterol in maščobne kisline in imeli pomembno vlogo pri vzdrževanju celovitosti membran prvih evkariontov.

IV. I. SUBSTRATNA SPECIFIČNOST
Do sredine 90.-ih let so določili že več kot 300 sekvenc genov citokromov P450. Eden od načinov določanja teh proteinov je z metodo substratne specifičnosti, ki pa ni možna za ločevanje vseh proteinov, saj so si nekateri zelo podobni v molekulski masi in tudi drugih kemijskih lastnostih. Drug način določanja substratne specifičnosti je ta, da so sprožili izražanje cDNA (komplementarna DNA) točno določenega proteina prek ekspresijskega vektorja v primernem celičnem izraznem sistemu, kjer ta oblika citokroma P450 v osnovi ni prisotna in ga lahko potem nedvoumno določimo, tako da dodamo v celico substrat in spremljamo encimsko aktivnost.

IV. II. INDUKCIJA CITOKROMOV P450
Indukcija citokromov P450 je poznana že 60 let, kot induktorji pa nastopajo ekso in endogene spojine. Mehanizma sta dva: translacijski in posttranslacijski. Iz poznavanja induktorja pa še ne moremo določiti mehanizma. Translacijski pomeni, da induktor sproži sintezo mRNA, pri posttranslacijskem načinu pa mRNA že obstaja, vendar je stabilizirana.
Primer: Poskus so izvajali na podganah, ki so jih postili in na diabetičnih podganah, in sicer so jim dajali majhne organske molekule – etanol, aceton in pirazol, zaradi katerih se poveča količina CYP2E1. Pri prvih živalih se je povečala količina citokroma, ne da bi se zvišala koncentracija mRNA, ker pirazol stabilizira encim in prepreči njegovo proteolizo. V primeru diabetičnih podgan, pa je šestkrat povečano indukcijo citokroma spremljalo desetkratno povečanje količine mRNA, nivo transkripcije gena pa ostal enak. To naj bi bila posledica stabilizacije mRNA.

IV. III. Polimorfizem
Obstaja velika količina genov oz. veliko različnih oblik citokromov P450 v populaciji, kar ima za posledico precejšnje razlike v učinkovitosti metabolizma, npr. zdravil. V majhnem odstotku populacije so prisotne takšne kombinacije gena, da posameznik ni sposoben metabolizirati določene substance v zadostni meri in detoksifikacija ni možna dovolj hitro, seveda, če je aktivnost zdravila odvisna od njegove nemetabolizirane oblike. Tem ljudem pravimo revni, ubogi metabolizatorji (poor metabolizers).

V. INHIBITORJI CITOKROMOV P450
V začetku so inhibitorje uporabili v poskusih dokazovanja delovanja citokromov P450 v določenem metabolnem procesu. Prisotnost encima je najlažje ugotoviti z merjenjem absorbnosti pri 450 nm, če je nanj vezan CO, ki hkrati deluje kot inhibitor, saj se kisik ne more vezati in monooksigenacije ni, s tem tudi ni produktov. Vlogo citokroma P450 v katalizi domnevnega substrata, pa so ugotovili tako, da so povzročili prenehanje inhibicije CO s svetlobo 450 nm. Na ta način so pokazali, da so steroidi substrati v mitohondrijih nadledvične žleze, kjer nastaja adrenalin, pozneje pa tudi za zravila v mikrosomih hepatocitiv.
Vendar pa je to nespecifična inhibicija, ki deluje na vse vrste citokromov P450 istočasno. Da bi natančno določili vlogo posameznega citokroma, so potrebni specifični inhibitorji. Razvili so monospecifična protitelesa, toda še vedno se ne da določiti, ali je samo ena oblika citokroma odgovorna za reakcijo, ker je prišlo do njene inhibicije. Močna strukturna podobnost citokromov namreč omogoča, lahko več citokromov katalizira isto reakcijo. To še posebej velja za citokrome P450 iste genske družine, ki kažejo imunološko nespecifičnost, ista protitelesa lahko inhibirajo več vrst encimov.
V zadnjem času si prizadevajo razviti inhibitorje, ki so vezani na mehanizem, t.i. samomorilski substrati, ki so močno podobni pravim substratom določenega citokroma P450 in so visoko specifični, vendar pa se v procesu katalize pretvorijo v ireverzibilno, kovalentno vezan produkt – inhibitor, na prostetično skupino ali kam drugam na protein. To predstavlja tudi potencial v razvoju zelo specifičnih zdravil.

VI. ELEKTRONSKI TRANSPORTNI SISTEM
Za katalizo sta potrebna dva elektrona, problem pa postavlja direkten in hkraten prenos na citokrom P450 z NADPH. Piridinska nukleotida sta donorja elektronov, toda hemski del proteina ima samo eno prostetično skupino, ki lahko naenkrat sprejme en sam elektron. Protein, ki služi kot prenašalec elektronov z NADPH mora imeti kapaciteto dveh elektronov in obenem zmožnost oddati en sam elektron. To delo opravlja NADPH-odvisna flavoprotein reduktaza, kjer v primeru mitohondrija elektrone posreduje intermediatu Fe-S proteinu, in jih ta nato odda citokromu P450, v endoplazemskem retikulumu pa prenos poteče direktno.
Aktivna redoks skupina flavinskega dela encima je izoaloksazinski obroč, ki je lahko reduciran z enim ali dvema elektronoma.
Slika 5: Struktura oksidiranega in reduciranega FAD in FMN

VI. I. Prenos elektronov v endoplazemskem retikulumu
V endoplazemskem retikulumu NADPH da elektrona flavoproteinu NADPH-citokrom P450 reduktazi (podganji ima molekulsko maso ~77kDa) in vsebuje tako flavin adenin dinukleotid (FAD), kot tudi flavin mononukleotid (FMN) kot prostetični skupini. Amino konec encima vsebuje veliko hidrofobnih ostankov, s katerimi je zasidran v membrano endoplazemskega retikuluma. FAD služi kot sprejemno mesto elektronov iz NADPH, FMN pa vsakega posebej odda citokromu P450. Ker je vsaka flavinska molekula lahko reducirana z enim ali dvema elektronoma, reduktaza pa vsebuje dve, se lahko elektroni shranijo med obema molekulama pred prenosom na končno mesto.
Vse reakcije, ki jih katalizira NADPH-citokrom P450 reduktaza, pa ne potekajo na ta način. V določenih primerih se drugi elektron ne prenese direktno z encima, ampak z drugega, precej manjšešega citokroma b5 , ki je prav tako hemski protein, ki ga reducira bodisi NADPH-citokrom P450 reduktaza bodisi NADH-citokrom b5 reduktaza. Zakaj se to dogaja ni poznano.
Citokrom b5 pa ima tudi drugo funkcijo in ni udeležen samo kot pomoč v reakcijah citokromov P450, ampak je prenašalec elektronov z NADH na encim desaturazo maščobnih kislin, ki katalizira tvorbo dvojnih vezi.

VI. II. Prenos elektronov v mitohondriju
Encim, ki v tem primeru skrbi za prenos elektronov z NADPH, je NADPH-adrenoksin reduktaza in je precej šibko vezan v mitohondrijsko membrano. Ime adrenoksin je zato, ker so ga prvič izolirali iz celic nadledvične žleze. Molekulska masa govejega encima znaša ~51 kDa. Protein vsebuje samo FAD.
Direkten prenos elektronov ni mogoč in kot posrednik služi majhen protein adrenoksin (12,5 kDa). Tudi adrenoksin je šibko vezan z interakcijo s samim membransko vezanim citokromom P450. Vsebuje Fe3+-S skupino, ki ima vlogo redukcijskega centra. V celotnem prenašalnem kompleksu sta zato potrebni dve molekuli adrenoksina, prva sprejme elektron z reduktaze, druga pa ga odda na citokrom P450.
Sinteza mitohondrijskih prenašalnih komponent poteka v citosolu, v obliki prekurzorjev z veliko molekulsko maso, ki jih nato po transportu v mitohondrij, proteaze preoblikujejo v manjše proteine, ki lahko opravljajo svojo funkcijo.

VII. FIZIOLOŠKE FUNKCIJE CITOKROMOV P450
Citokromi P450 metabolizirajo vrsto lipofilnih komponent endogenega in eksogenega izvora. Ti encimi lahko katalizirajo:
 Preproste hidroksilacije ogljikovega atoma metilne skupine
 Vnos hidroksilne skupine v metilni ogljik nekega alkana
 Hidroksilacijo aromatskega obroča (nastanek fenola)
 Adicijo kisika prek dvojne vezi (tvorba epoksida)
 Dealkinacije (Kisik je vnesen v C-H vez, nastane nestabilen produkt, ki se pregradi v primarni alkohol, amin ali tiolno (SH) komponento).
 Ostalo: oksidacije N, S, P in dehalogenacije.
(Glej prilogo!)

VII. I. Sinteza steroidnih hormonov
Sinteza steroidnih hormonov poteka v skorji nadledvične žleze in v spolnih organih. Zanjo sta potrebna tako mitohondrialni citokrom P450, kot citokrom P450 ER . Sintezo steroidnih hormonov razdelimo v tri dele, ob enem pa so vsi trije povezani v celoto (slika 6). V nadledvični žlezi se sintetizirata aldosteron in kortizol ter androstenedion. Aldosteron je mineralkortikoid, ki regulira ravnotežje vode in soli v telesu.
Kortizol je glukokortikoid, ki upravlja metabolizem proteinov, ogljikov hidratov in lipidov.
Androstenedion je posredni prekurzor estrogena in neposredni prekurzor testosterona (Zaključek sinteze androstenediona poteče v gonadah.), poleg tega pa regulira sekundarne spolne znake. Slika 6: Shema poteka sinteze steroidov

VII. I. I. Cepitev stranske verige holesterola
Skupen korak sinteze zgoraj naštetih hormonov je cepitev stranske verige holesterola in s tem pretvorba le-tega v pregnenolon. Od tu naprej gre sinteza vsakega hormona po svoji poti.
Cepitev stranske verige holesterola potega v mitohondrijih nadledvične žleze (mitohondrialni CYP).
Reakcija (Glej prilogo!) se začne s postopno hidroksilacijo ogljikov C-22 in C-20 v stranski verigi holesterola. Najprej nastane 22-hidroksiholesterol, nato pa 20,22-dihidroksiholesterol. Sledi cepitev C-C vezi med C-20 in C-22 in odcep izokaproičnega aldehida. Produkt reakcije je pregnenolon, ki ima 21 ogljikov. Pri vsakem koraku se porabi molekula kisika in en elektron iz NADPH. Vse korake katalizira CYP11A1.

VII. I. II. Sinteza aldosterona
Pregnenolon se prenese iz mitohondrija v citosol, kjer ga oksidira 3β-hidroksisteroid dehidrogenaza v progesteron.
Progesteron je metaboliziran v 11-deoksikortikosteron (DOC). Ta korak katalizira CYP21A2 (21-hidroksilacija), ki je v ER. Sledi hidroksilacija DOC-a z mitohondrialnim CYP11B1 in CYP11B2 v aldosteron prek več vmesnih stopenj (CYP11B2 katalizira 11β-hidroksilacijo in 18-hidroksilacijo.).Aldosteron nastane v zoni glomerulozi.

VII. I. III. Sinteza kortizola
Začne se lahko bodisi iz stopnje pregnenolona ali pa progesterona. Najprej poteče 17α-hidroksilacija, nastane 17α-hidroksiprogesteron (17α-hidroksipregnenolon); katalizira jo CYP17. Sledi 21-hidroksilacija, produkt je 11-deoksikortizol (CYP21A2). Ta se transportira v mitohondrij, kjer poteče hidroksilacija C-11 atoma, s pomočjo CYP11B1, nastane kortizol. Sinteza kortizola poteče predvsem v zoni fascikulati skorje nadledvične žleze.
Sinteza steroidov
Začne se lahko na stopnji 17α-hidroksipregnenolona ali pa 17α-hidroksiprogesterona. Na C-17 pride do izgube acetilne skupine. Iz prvega nastane dehidroepiandrosteron (DHEA), iz 17α-hidroksiprogesterona pa nastane direktno androstenedion. (DHEA se pretvori v androstenedion z dehidrogenacijo -OH skupine na tretjem C atomu.) Dehidrogenacija je tu katalizirana s CYP17. Zanimivo je, da je ta citokrom isti pri 17-hidrogenaciji progesterona. Mehanizem, ki kontrolira CYP17, ali naj ta izvede le17-hidroksilacijo ali še odcepi acetil, še ni znan.

VII. I. IV. Sinteza estrogenov – Aromatizacija
Estrogeni se sintetizirajo iz androgenov z aromatizacijo (Glej prilogo!). Katalizira jo CYP19. Aromatizacija je zaporedje večih hidroksilacij, odstrani se C-19 in s tem nastane aromatski obroč.
Reakcija se začne z enolizacijo keton skupine na C-1, sledijo hidroksilacije (CYP19/O2). Na C-19 se veže Fe3+-OOH ion (peroksidni napad), ta povzroči odcep C-19 ter eliminacijo vodikovega atoma. C-18 zaradi primankljaja enega elektrona vzpostavi še eno vez s C-20 in tako nastane aromatski obroč. Pri zadnjem koraku reakcije, poleg CYP19, sodeluje še P450arom (Aromataza – član poddružine CYP19).

Klinični primer: Produkcija steroidov v nosečnosti (kooperativnost encimskih sistemov)
V dobi nosečnosti se produkcija steroidnih hormonov močno poveča. Ženska proti koncu gestacijske dobe na dan proizvede približno 1000x več teh hormonov, kot pa ženska, ki ni noseča. Ravno tako se močno razlikuje tudi način nastajanja steroidnih hormonov v nosečnosti.
Prve štiri tedne gestacije je glavno mesto produkcije steroidov rumeno telesce (corpus luteum) v ovariju. Po tem času začne estrogene proizvajati tudi placenta, ki po osmih tednih naddominira corpus luteum. Nas zanima ta drugi del nastanka steroidov. Zanimivo je, da posteljica nima citokroma CYP17 (17α-hidroksilacija, odcep acetilne skupine). Placenta lahko katalizira cepitev stranske verige holesterola in nastanek pregnenolona ter oksidacijo le-tega v progesteron. Progesteron se nato izloči v krvni obtok. V nadledvični žlezi fetusa se progesteron pretvori v DHEA, ta pa potuje v fetusova jetra, kjer se hidroksilira C-16. 16α-hidroksi-DHEA potuje nazaj v placento, kjer poteče aromatizacija v estrogen estradiol.

VII. II. Ostale reakcije katalizirane s citokromi P450
Ostali citokromi P450 aktivirajo vitamin D3 (hormon), tako da producirajo 1,25-dihdroksi vidamin D3 (aktivna oblika). Levkotrien B4 (kemotaktik) pretvorijo v 20-hidroksi-levkotrien B4 (manj aktivna oblika). Metabolizirajo tudi arahidonsko kislino, iz katere tvorijo epokside, ki imajo pomembne regulatorne funkcije.

VII. III. Ksenobiotiki
Ime ksenobiotiki pomeni »tuji življenju«. So terapevtska zdravila, industrijski stranski produkti, dotatki hrani, pesticidi, ... V telo največkrat pridejo preko prebavnega trakta, lahko pa tudi prek pljuč, kože in sluznice. Citokromi P450 oksidirajo vrsto ksenobiotikov, predvsem lipofilne. Adirajo hidroksilno skupino, kar poveča topnost ksenobiotika v vodnem okolju celice.
Številni ksenobiotiki se nabirajo v celici, kjer motijo njeno delovanje. S posredovanjem citokromov P450 se ponavadi zmanjša njihova farmakološka učinkovitost in toksičnost. Zaradi povečane topnosti se lahko ksenobiotiki izločijo v blato, oziroma urin. Nekateri ksenobiotiki pa se lahko razgradijo že v telesu, s pomočjo konjugacijskih encimov; večina teh je v jetrih.
V številnih primerih lahko citokrom P450 naredi iz malo škodljivega ksenobiotika zelo škodljivo, karcinogeno molekulo (Temu pravimo bioaktivacija.). To ne pomeni, da bo organizem zbolel, temveč da je takšna oblika molekule bolj dovzetna za vezavo konjugacijskih encimov, ki jo uspešno razgrajajo. Citokrom na takšen način ksenobiotik izpostavi metabolnim (konjugacijskim) encimom.

Primer: benzo[a]piren
Benzo[a]piren je znan onesnaževalec okolja, nastane z gorenjem premoga, sežiganjem delov rastline tobakovca in hrane pečene na žaru, je tudi industrijski stranski produkt. Veže se na arilni ogljikohidratni receptor in inducira citokrome poddružine 1A, s čimer poveča lastno presnovo. Encimi ga v živalih pretvorijo v zelo karcinogeno molekulo, v bakterijah pa v mutageno.
Pretvorba se začne z epoksidacijo med 7. in 8. C atomom. Sledi hidroksilacija s pomočjo epoksidne hidrolaze (benzo[a]piren 7,8-dihidrodiol). Poteče še ena epoksidacija, med C-9 in C-10 (benzo[a]piren 7,8-dihidrodiol-9,10-epoksid). Začetna spojina je rahel karcinogen, z biotransformacijo pa nastane veliko bolj nevarna molekula, ki pa jo konjugacijski encimi lažje razgradijo. Slika 7: Benzo[a]piren

Če povzamem: Citokromi P450 doda ali pa izpostavi funkcionalne skupine (npr. polarna –OH skupina), ki jih prepoznajo drugi (konjugacijski) encimi in razstrupijo molekulo.






















VIRI IN LITERATURA
 Nelson D. L., M. M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry, 2003, third edition
 http://www.icgeb.org/~p450srv/
 http://www.uky.edu/Pharmacy/ps/porter/CPR_enzymology.htm
 http://www.arches.uga.edu/7Ehanhan/bcmb8010/
Nadaljno branje:
 http://www.sis.nlm.nih.gov/ToxTutor/Tox2/a41.htm
 http://www.pharmj.com/pdf/hp/200206/hp_200206_cytochromes.pdf
 http://www2.mf.uni-lj.si/~bikevams/detoksifikacija.doc