Transkripcijski faktorji
Imamo podrobne informacije o veliko skupinah proteinov, ki regulirajo transkripcijo z uporabo določenih kombinacij za vezavo na DNA:
- Steroidni receptorji: vsak receptor se aktivira z vezavo z določenim steroidom. Najbolj je analiziran glukokortikoidni receptor. Steroidni receptorji člani superdružine transkripcijskih faktorjev, ki imajo na splošno enak način delovanja.
- Cinkovi prsti: Njihovo zaporedje obsega določeno DNA-vezavno področje. Na začetku so ga prepoznali v faktorju TFIIIA, ki je potreben, da RNA polimeraza III prepiše 5S rRNA gene. Od takrat so ga prepoznali v številnih drugih transkripcijskih faktorjih.
- Heliks-obrat-heliks kombinacija je bila na začetku določena kot DNA-vezavno področje za bakteriofagne zaviralce. Heliks-obrat-heliks je sestavljen iz 20 aminokislin, ki so zvite v dva α-heliksa (vsak je dolg 7-9 amiokislinskih ostankov, vmes pa je en β-zavoj). En od α-heliksov, ki štrli izven proteina, se veže na veliko brazdo DNA; drugi pa leži za nek kót čez DNA. Podobna oblika te kombinacije je v homeodomeni (regulacijska beljakovina iz 60 aminokislin, ki se veže na DNA). Zaporedje homeodomene so večkrat opazili v proteinih, ki so kodirani z geni za razvojno regulacijo v Drosophili (vinska mušica-insekt, ki ga pogosto uporabljajo, za genske raziskave). Je pa tudi prisotna v genih za sesalske transkripcijske faktorje.
- Heliks-zanka-heliks je amfipatično zaporedje, dolgo 50 aminokislinskih ostankov. Prepoznali so ga v nekaj razvojnih regulatorjih in genih, ki kodirajo evkariontske DNA-vezavne proteine. Vsak amfipatičen heliks predstavlja hidrofobne ostanke na eni strani in nabite ostanke na drugi strani. To zaporedje omogoča proteinom da se dimerizirajo in področje v bližini te kombinacije naveže stik z DNA. Vezavo na DNA narekuje kratko zaporedje bazičnih aminokislinskih ostankov. Dolžina povezovalne zanke variira od 12-28 aminokislin.
- Levcinske zadrge so sestavljene iz raztegnjenega niza aminokislin z levcinskimi ostanki na vsakem sedmem mestu. Levcinske zadrge v enem polipeptidu interagirajo z zadrgo v drugem polipeptidu, in tako tvorijo dimer. Blizu vsake zadrge je zaporedje pozitivno nabitih ostankov, ki so vpleteni pri vezavi na DNA.

Slika 1: Strukture, ki sodelujejo pri specifičnih interakcijah TF z DNA



Cinkovi prsti

Strukturo cinkovih prstov vsebujeta dve vrsti vezavnih proteinov: klasični cinkovi prsti in steroidni receptorji (večcisteinski cinkovi prsti).
Struktura cinkovih prstov
Večina proteinov vsebuje lokalna področja sekundarnih struktur, ki se zvijejo skupaj v končno 3D strukturo proteina. Najpogostejši sekundarni strukturi sta α-heliks oz. α-vijačnica in β struktura.

Zaporedje cinkovih prstov ima ime po zanki aminokislin, ki štrli navzven cinkovega vezavnega mesta in je opisano kot Cys/His prst. Prst sam je zgrajen iz 23 aminokislin in povezave med prsti, ki so sestavljene iz 7-8 aminokislin. Začetni del sekvence (N-terminalni konec) cinkovega prsta prevzame obliko majhnega β lista. Sestavljen je iz dveh β struktur, ki tvorita list tako, da se druga struktura zvije nazaj na prvo. Drugi del sekvence (C-terminalni konec) se zvije v α-heliks. Dva cisteina se nahajata na dnu β lista, dva histidina pa na dnu α-heliksa. Vse štiri aminokisline povezuje cinkov atom – povezuje β lista in α-heliks.



Vsak prst vsebuje tri hidrofobne aminokisline (npr. fenilalanin). V linearni predstavitvi so hidrofobne aminokisline relativno daleč narazen, v 3D prostoru pa lahko interagirajo in sodelujejo pri zvijanju minidomen. Pri zvitju so dokaj blizu skupaj in tako oblikujejo hidrofobno jedro, ki stabilizira strukturo. Prsti so organizirani kot enojni niz. Raztezek prstov je lahko do 9 ponovitev, ki lahko zasedajo skoraj cel protein (kot v TFIIA).




Vloga cinkovih prstov pri vezavi na DNA

V transkripcijskih faktorjih so lahko področja, ki vsebujejo cinkove prste. Iz žabe Xenopus laevis so izolirali protein z imenom transkripcijski faktor IIIA (TFIIIA), ki je potreben za aktivacijo gena 5S RNA. 5S RNA pa je sestavni del ribosomov, na katerih se molekule mRNA prevajajo v protein. V TFIIIA so odkrili zaporedje cinkovih prstov.
Cinkovi prsti so sami odgovorni za vezavo na DNA in so samostojne »bralne glave«, ki so povezane preko gibljivih veznih členov. Prsti kontaktirajo z zaporednimi mesti treh baznih parov na DNA. α-heliks vsakega prsta se usmeri v notranjost velike brazde, pri čemer se naslanja na eno od njenih sten.

Ko so primerjali aminokislinsko zaporedje vsakega prsta v Drosophila (mušica) Krox-20 proteinu, so ugotovili, da dva zunanja prsta (1. in 3. prst) vsebujeta glutaminske ostanke na poziciji 18 v prstu in arginin na poziciji 21 v prstu (na N-terminalnem koncu α-heliksa). Medtem ko se sredinski prst od njiju razlikuje po tem, da ima na teh mestih histidinske in treoninske ostanke. Če se ti dve aminokislini spremenita, je to kritično pri določanju DNA zaporedja, ki ga prepozna 2. prst. Tako se 2. prst veže na enaka zaporedja kot 1. in 3. prst. V vsakem primeru pa je ena aminokislina v stiku z eno bazo v paru.

Če pride do delecije, se izreže več cinkovih prstov in to se v molekuli kaže kot izguba sposobnosti vezave na DNA. Zamenjava cisteina s serinom v cinkovem prstu v Drosophili Kruppel proteinu odpravi sposobnost vezave cinkovega prsta in to se konča v mutirani muhi, ki pa je ne ločimo od muhe, ki jo dobimo, če izbrišemo celoten gen. To nam pove, da je za DNA vezavo odgovoren samo cinkov prst in ne celoten transkripcijski faktor.

En sam cinkov prst ne more opraviti vezave na DNA, medtem ko več prstov skupaj pa to lahko stori. To namiguje, da je DNA vezava s cinkovim prstom odvisna od interakcij med sosednjimi prsti in razloži, zakaj transkripcijski faktorji, ki vsebujejo cinkove prste vedno vsebujejo več kopij zaporedja cinkovih prstov.

Slika 4: Model interakcije cinkovega prsta z DNA
















Steroidni receptorji

Steroidni hormoni so derivati holesterola in imajo mnogo vplivov na biološke procese, kot naprimer rast, metabolizem in razvijanje spolnih znakov (estrogen in androgen). Tako se receptor aktivira in se lahko poveže z omejenih številom specifičnih mest na kromatinu. Ta vezava z DNA aktivira trankripcijo genov. Receptorski proteini so bili med prvimi odkritimi transkripcijskimi faktorjami, zato, ker imajo sposobnost vezave z radioaktivno označenimi steroidnimi ligandi. Geni, ki so sproženi zaradi določenega steroidnega hormona vsebujejo specifično vezavno mesto za receptor-hormonski kompleks. Steroidni hormon vsebuje več ponavljajočih se zaporedij, ki izzovejo odgovor.. Receptor se veže na DNA kot dimer.

Nekatere bolezni in uporaba cinkovih prstov v terapevtske namene

Znanje s področja transkripcijskih faktorjev in cinkovih prstov nam zelo pomaga pri razumevanju določenih bolezni. Odkrili so, da je ledvični rak, imenovan Wilmov tumor, posledica genske mutacije, ki prepreči normalno vezavo cinkovega prsta v nekem proteinu z molekulo DNA. Ugotovili so tudi , da lahko z vstavljanjem določenih transkripcijskih faktorjev v paciente aktiviramo gene, ki sprožijo razraščanje krvnih žil. Cinkovi prsti omogočajo zavrtje infekcije celic v kulturi, ki ima človeške viruse, kar pomeni, da bomo v prihodnosti to znanje lahko uporabili v terapevtske namene.


Levcinske zadrge

V levcinskih zadrgah se levcinski ostanki pojavljajo na vsakih sedem aminokislin. To je na vsaka dva obrata na isti strani heliksa. Povrh ti levcinski ostanki očitno igrajo pomembno vlogo pri funkcionalnosti proteina. Dolgostranske verige levcinskih ostankov, ki se raztegujejo iz enega polipeptida, se lahko prepletajo s tistimi, ki so analogni heliksu sekundarnega polipeptida. Tako se formira zaporedje, poznano kot levcinska zadrga. Dvolevcinsko bogate regije se povezujejo z vzporednim načinom z obema heliksoma, ki sta orientirana v isto smer. Ta učinek je lahko tudi dosežen z metioninskim ostankom, ki ima tako kot levcin dolgo stransko verigo, s stransko metilno skupino, ne pa z ostalimi hidrofobnimi aminokislinami. Zamenjava individualnih levcinskih ostankov uniči sposobnost nepoškodovanega proteina, da formira dimer, kar kaže na nujnost vloge tega področja v dimerizaciji. Poleg njene vloge pri dimerizaciji je levcinska zadrga tudi nujno potrebno za DNA vezavo. Mutacije v zadrgi, ki preprečujejo dimerizacijo tudi preprečujejo DNA vezavo.

Slika 6: Levcinska zadrga



Zadrga sama po sebi ni DNA vezavno področje molekule in se direktno ne veže na DNA. Zato verjamejo, da levcinska zadrga služi kot nedirektna strukturna vloga v DNA vezavi, kot pospeševalec dimerizacije, ki se pokaže v pravilni postavitvi dveh osnovnih DNA vezavnih področij v dimerski molekuli, da sploh pride do DNA vezave. Do vezave molekul, ki vsebujejo osnovna DNA vezavna področja, lahko pride po dimerizaciji, ki je posredovana z levcinskimi zadrgami ali z disulfidnim mostom, ni pa možno, da bi do nje prišlo s pomočjo nepovezanih monomernih molekul. V faktorjih, ki imajo osnovno DNA vezavno področje, formira transkripcijski faktor po dimerizaciji preko levcinske zadrge rotacijsko simetrični dimer, ki se veže na DNA preko viličastega osnovnega področja, ki ga tvorijo α-strukture. Ta dva heliksa potem sledita dolžini DNA v nasprotnih smereh in se odzivata na dvojico simetričnih struktur v DNA prepoznavnem mestu in formirata školjčni ali škarjast oprijem okrog DNA, kar se konča kot zelo trdna vezava proteina na DNA.
Povzetek

Preden se gen aktivira, se morajo na njegov del – promotor – pripeti številni proteini, ki jim s skupnim imenom pravimo transkripcijski faktorji (TF). Ta sistem deluje kot stikalo, ki omogoča encimu prepis genske informacije z DNA na RNA. S transkripcijo nastala RNA največkrat služi kot predloga za sintezo proteinov (m-RNA), včasih pa je že RNA končni produkt. Zaporedje cinkovih prstov ima ime po zanki aminokislin, ki štrli navzven cinkovega vezavnega mesta in je opisano kot Cys/His prst. Transkripcijski faktorji, ki vsebujejo cinkove prste vedno vsebujejo več kopij zaporedja cinkovih prstov. V levcinskih zadrgah se levcinski ostanki pojavljajo na vsakih sedem aminokislin. Zadrga sama po sebi ni DNA vezavno področje molekule in se direktno ne veže na DNA.