1. UVOD

Genska terapija ali gensko zdravljenje je zdravstven poseg, pri katerem se v splošnem v celico vnesejo nukleinske kisline za nadomestilo, spremembo ali utišanje izražanja genov. Njen cilj je zdravljenje podedovanih ali pridobljenih genskih bolezni.
Z vedno večjim napredkom v znanosti smo odkrili poti, po katerih potekajo bolezenski procesi in zapise v genskem materialu, kjer so kodirani proteini, ki kontrolirajo te celične procese. Proteini pa zaradi svoje velikosti, kompleksne strukture in težke dostopnosti (velja predvsem za znotrajcelične in jedrne beljakovine) večinoma niso primerni za zdravljenje z običajnimi farmakološkimi postopki in zdravili. Vedno več upanja budita hitro razvijajoča se znanost – molekularna genetika in njena veja genska terapija. Slednja v sebi združuje metode in tehnike za vzpostavitev normalnega delovanja celičnih beljakovin. Bralca bi v pričujočem besedilu radi seznanili z osnovnimi pojmi, idejami in postopki, uporabnostjo in težavami, povezanimi z gensko terapijo.
Molekula, ki nosi gene, se imenuje vektor. Za idealen vektor naj bi veljalo:

1. Sposoben naj bi bil prenašanja čim večjih odsekov nukleinskih kislin oziroma kosov DNA in RNA zelo različnih velikosti (od oligonukleotidov do več genov).
2. V organizem naj bi ga bilo moč vnesti po neinvazivni poti.
3. Priprava vektorja naj bi bila preprosta in poceni, hkrati pa naj ne bi bila ogrožujoča za raziskovalno osebje.
4. Omogočal naj bi celično oz. tkivno specifično dostavo.
5. Omogočal naj bi različno dolgo, a po trajanju določljivo izražanje beljakovine.
6. Vektor naj ne bi povzročal škode zdravim, normalnim celicam.
7. Prav tako naj ne bi bil imunogen.

Najpogosteje se uporabljajo virusni, vedno bolj pa se razvijajo tudi ne-virusni vektorji. Med njimi idealnega vektorja še niso našli, saj ima vsak svoje pomanjkljivosti in omejitve. Težave se pojavljajo pri:

1. velikosti vstavljenega genetskega materiala, saj imajo nekateri virusni vektorji izredno majhno kapaciteto,
2. dostavi nukleinskih kislin v celice, saj nekateri vektorji inficirajo le določene, na primer deleče se celice.
3. Koliko časa traja izražanje genov, je tudi izrednega pomena, saj je za nekatere bolezni potrebno le kratko, za druge stalno izražanje.
4. Nekateri virusni vektorji lahko predvsem izzovejo imunski odziv, kar močno zmanjša uspešnost transfekcije, predvsem ob vnovičnem vnosu.
5. Pri ne-virusnih vektorjih pa je glavna težava predvsem slaba učinkovitost prenosa.
6. Potencialna težava se pojavlja tudi pri vektorjih, ki genski material vgradijo v celični genom. To lahko prekine normalno nukleotidno zaporedje kakega pomembnega celičnega (onko)gena, kar lahko vodi v razvoj novih genskih bolezni, tudi raka; slednjega predvsem pri spremembi zapisa tumorje zavirajočih genov. Čeprav danes še ne poznamo idealnega vektorja, raziskovanja v tej smeri obetajo vedno boljše vektorje.
Genska terapija je zaenkrat omejena na somatske celice. Gensko popravilo celic na zgodnji stopnji razvoja zarodka bi omogočilo preživetje in razvoj zarodkov z genskimi okvarami, zaenkrat nezdružljivimi z življenjem, vendar pa številni etični pomisleki glede možnosti zlorabe te metode za selekcijo osebkov z določenimi lastnostmi in pomanjkanje informacij o možnih posledicah preprečujejo, da bi postopek prišel v praktično uporabo.
2. VIRUSNI VEKTORJI

Virusi so zaradi svojega naravnega življenjskega cikla (prenos virusnega genoma v gostiteljsko celico in ekspresija kodiranih beljakovin) primerno izhodišče za izdelavo vektorjev za prenos eksogenega genskega materiala. Pri pripravi vektorja je v večini primerov treba zatreti njegovo sposobnost razmnoževanja. Da je insercija transgena mogoča, je treba odstraniti še nekaj elementov genoma. Dobra lastnost pri tem je, da navadno že z odstranitvijo virusnih genov, potrebnih za razmnoževanje virusa, pridobimo prostor za vstavitev transgena v virusni genom. Dodatne modifikacije so odvisne od vrste virusa.
Danes je večina vektorjev, ki se jih uporablja v genski tehnologiji, virusnih. Uporabljajo se predvsem retrovirusi, lentivirusi, adenovirusi, adenovirusom pridruženi virusi (adeno-associated virusi) in herpesvirusi.

2.1 RETROVIRUSI
So majhni kroglasti RNA virusi (s premerom ok. 100nm), ki imajo diploiden genom v obliki dveh linearnih pozitivno polarnih enojnovijačnih RNA molekul. Vsaka skupaj z jedrnimi beljakovinami nukleoproteini oblikuje po eno vijačno nukleokapsido, obe nukleokapsidi pa obdaja še ikozaedrična kapsida. Najbolj zunanji del viriona je lipidna ovojnica z 8nm dolgimi peplomeri Med ikozaedrično kapsido in zunanjo ovojnico je še matrična beljakovina. Okužijo in razmnožujejo se lahko le v delečih se celicah, saj je za vstop virusa v jedro potreben razpad jedrne ovojnice med mitozo. Svoj genom vgradijo v gostiteljevega (reverzna transkriptaza virusno RNA prepiše v dvovijačno DNA, ki se vgradi v gostiteljev genom s pomočjo encima integraze), zato so primerni za dolgotrajno ekspresijo genov. Direktna skoraj naključna vgraditev pa odpira vprašanje varnosti, saj bi lahko imela za posledico izostanek izražanja določenega gena ali njegovo nepravilno izražanje, bodisi kvantitativno, bodisi kvalitativno. Pri retrovirusih, ki se ne morejo razmnoževati (glej nadaljevanje), tega pojava še niso opazili.
Večina retrovirusov je izdelanih iz Moloney murine leukemia virusa (MMLV) z odstranitvijo gag, pol in env genov. S tem sta preprečena možnost razmnoževanja virusa in imunski odziv gostitelja, povečan pa je prostor za eksogeni gen. Ta je lahko velik do 8kb in lahko vsebuje tudi sekvence, ki vsebujejo promotorsko in enhancersko zaporedje. V ta namen se lahko uporabijo tudi regulatorna zaporedja, ki se nahajajo v LTR (long terminal repeats) virusnega genoma.




Po deleciji zgoraj naštetih genov se lahko virusi razmnožujejo le v posebnih celičnih kulturah za paketiranje (packaging), ki namesto njih izdelujejo beljakovine, ki so jih kodirali ti geni. Takšna celična linija nastane s prenosom bakterijskega plazmida, ki vsebuje te gene, v celično kulturo. Pripravljeno celično kulturo okužimo z rekombinantnim virusom, ki se v celični kulturi razmnožuje. Tako pridobljeni virusi se niso sposobni samostojno razmnoževati in vsebujejo želen eksogeni gen.
Sposobnost virusov, da lahko okužijo specifično vrsto celice, temelji predvsem na interakcijah med virusnimi proteini ovojnice in receptorji v celični membrani. MMLV ima ekotropno membrano, kar pomeni, da je sposoben okužiti samo celice določene živalske vrste (species), v tem primeru miši. Zato so potrebne modifikacije virusnih beljakovin ovojnice, da je virusni vektor uporaben tudi za človeka. Če MMLV namesto svojih proteinov ovojnice uporabi VSV-G (glikoprotein virusa vezikularnega stomatitisa), pridobi več možnih gostiteljev (postane amfotropen). Vektor je tudi bolj stabilen, kar lahko uporabimo za pridobivanje višjih titrov vektorja z ultracentrifugiranjem. Pomanjkljivost uporabe VSV-G je toksičnost za celične kulture za paketiranje.
Najpogostejši pristop je ex vivo transdukcija pacientovih celic. Tkivno kulturo se inficira z virusnim vektorjem in reinplantira v pacienta. Ta pristop je bil uporabljen pri zdravljenjih pomanjkanja adenozin deaminaze in hiperlipidemije. Drugi pristop je direktno in vivo injiciranje vektorjev v tkivo, kar se uporablja za zdravljenje solidnih tumorjev.

2.2 LENTIVIRUSI
Spadajo v rod Lentivirus znotraj družine Retroviridae (retrovirusi). Najbolje je preučen virus HIV-1 in vektorji izdelani iz HIV-1 imajo več potencialnih prednosti pred retrovirusi. Lahko namreč okužijo tudi celice, ki se ne delijo. To jim omogoča matrična beljakovina, ki vsebuje jedrno lokalizacijsko zaporedje, ki omogoči prestop t.i. preintegracijskega kompleksa v jedro. Preintegracijski kompleks tvorijo matrična beljakovina (ki jo kodira gen gag), encim integraza in v citoplazmi prepisana DNA, ki se po vstopu v jedro vgradi v celični genom. Prav tako kot retrovirusom se tudi lentivirusom onemogoči razmnoževanje z delecijo določenih genov in se jih pridobiva v celičnih kulturah za paketiranje.
Lentivirusi lahko okužijo tako hematopoetske celice kot tudi terminalno diferencirane celice, npr. mišične celice, nevrone, hepatocite in fotoreceptorje retine (ki se v času transfekcije ne delijo ali se sploh več niso zmožne deliti). Tudi tu se število možnih gostiteljev poveča z psevdotipiranjem z VSV-G.

2.3 ADENOVIRUSI
Adenovirusi so virusi z linearno, dvojno DNA vijačnico, brez zunanje ovojnice, z ikozaedrično nukleokapsido z značilnimi peplomeri in se razmnožujejo neodvisno od razmnoževanja gostiteljske celice.
Ker je CAR receptor (coxsackievirus and adenovirus receptor) za adenoviruse prisoten na skoraj vseh celicah, lahko okužijo različna tkiva, kot so respiratorni epitelij, žilni endotelij, srčna in skeletna mišičnina, periferno in centralno živčevje, hepatociti, eksokrini del pankreasa in veliko različnih tumorjev.
Genski vnos in ekspresijo lahko dosežemo v delečih in nedelečih se celicah. Vektor lahko vnesemo intravensko, intratekalno, intrakranialno, intraperitonealno, v žolčnik ali mehur ali pa kar direktno v parenhim organa.
Virus po infekciji celice ponavadi ostane v citoplazmi kot episom (vgradnja v DNA se zgodi redko in samo pri visokem nivoju infekcije v delečih se celicah) in dolgoročna ekspresija ni mogoča. To je še posebej moteče, če so tarča deleče se celice (kostni mozeg), ker lahko hčerinska celica ostane brez adenovirusnega episoma.
Ker odstranitev vseh adenovirusnih genov iz vektorja še ni uspela, ekspresija adenovirusnih proteinov vzbudi celični in telesni (humoralni) imunski odziv in posledično so okužene celice eliminirane, zaradi tega pa je zmanjšana tudi učinkovitost vsakega nadaljnjega vnosa.
2.4 ADENOVIRUSOM PRIDRUŽENI VIRUSI
(Adeno-Associated virusi)
So majhni ikozaedrični virusi (premera okrog 20nm) z enovijačno DNA negativne polarnosti in nimajo ovojnice. Spadajo v družino Parvoviridae in v rod Dependovirus. So nepatogeni, lahko učinkovito okužijo nedeleče se celice in lahko nosijo heterologne gene, pri čemer ne pride do potencialno imunogene ekspresije virusnih proteinov. Slabost teh vektorjev sta predvsem omejena velikost DNA, ki jo je moč vgraditi (do 5.2 kb), ker je genom virusa majhen, in pa nezmožnost, da bi dosegli visok virusni titer.
Adenovirusom pridruženi virusi se vežejo na heparan sulfat na površini celice. V celici so prisotni kot episom. Razmnoževanje je odvisno od virusa pomočnika-adenovirusa. V prisotnosti pomočnika je okužba litična, brez njega pa lizogena (virus se vgradi v gostiteljev genom in ostane latenten).
Ker lahko dosežemo dolgoročno ekspresijo in ker vektor ne vzbudi imunskega odgovora, je primeren za zdravljenje genskih nepravilnosti. Učinkovit je predvsem pri vnosu genov v skeletne mišice, CŽS, pljuča, jetra, GIT in oko. Še posebno so opogumljajoči rezultati kliničnih poskusov zdravljenja hemofilije (ekspresija faktorja IX).

2.5 VIRUS HERPES SIMPLEKSA 1
Je kroglast virus z veliko (152kb) linearno dvojno DNA vijačnico in z ovojnico. Razmnožuje se v jedru celice. Okuži lahko tako deleče kot nedeleče se celice in se ponavadi ne integrira v gostiteljev genom. Afiniteto ima predvsem do nevronskih tkiv, kar ga dela še posebej primernega za zdravljenje nevroloških obolenj, kot so na primer možganski tumorji in Parkinsonova bolezen. Slabosti sta citotoksičnost in pojav utišanja transgena, do katerega pride, če je okužba lizogena.
Vektorji, ki jim odstranimo gene, potrebne za virusno replikacijo, so sicer manj citotoksični in pri njih je dolgoročna ekspresija pogostejša, vendar je pri takih virusih okužba lizogena, prepisujejo pa se le nekatera zaporedja in nastanejo t.i. LAT-i (latency associated transcripts). Izražanje transgena tudi v času latence lahko dosežemo tako, da ga povežemo z regulatornimi zaporedji in promotorji, udeleženimi v prepisovanju LAT-ov.
Zaradi velikosti genoma so primerni za vgradnjo velikih genov. Uspešen je bil vnos cDNA za distrofin (14kb) v skeletno mišico miši z mišično distrofijo.

3. NEVIRUSNI DNA VEKTORJI

Kopica nevirusnih metod za vnos eksogene DNA je bila razvitih in testiranih, med drugim plazmidna DNA, DNA-liposomski in DNA-proteinski kompleksi ter z DNA pokriti zlati delci. Njihova prednost v primerjavi z virusnimi vektorji je enostavnejša in cenejša proizvodnja, vendar pa njihovo uporabnost v genski terapiji omejujeta prehodna ekspresija in manj efektivna transdukcija (prenos DNA v celice). Dalj trajajoča ekspresija naj bi bila možna z vstavitvijo določenega gena v transpozon, naravno prisoten mobilen genetski delec, ki se lahko vgradi na različna mesta celične DNA.

3.1 NEKOMPLEKSNA PLAZMIDNA DNA
Vbrizganje očiščene DNA ali m-RNA direktno v tkiva rezultira v prehodni ekspresiji vbrizgane genske informacije. To je bilo najbolje prikazano v mišičnem tkivu, kjer je vbrizganje nekompleksne (gole) DNA zelo učinkovito. Ta metoda je prav tako uporabna za kožo. Ekspresija proteinskega antigena v obeh tkivih je pokazala možnost uporabo te metode v procesu aktivne imunizacije (cepljenja). Klinični testi skušajo to metodo cepljenja izpopolniti. Metoda pa bi bila lahko koristna tudi za ektopično sintezo terapevtskih proteinov, npr. eritropoetina.
3.2 Z DNA POKRITI ZLATI DELCI Plazmidno DNA lahko pritrdimo na delce zlata premera približno 1μm in nato ta kompleks s pomočjo stisnjenega plina ali električne sile (iskre) "ustrelimo" v celico. To metodo lahko uporabimo na povrhnjih celicah kože (epidermis) ali pa na kožnih tumorjih (melanomih). Genska ekspresija traja le nekaj dni, kar je bolj posledica luščenja tarčnih epitelijskih celic, kot metode same po sebi. Ta metoda je idealna za gensko posredovano imunizacijo, kjer je za nastanek imunskega odziva potrebna le kratkotrajna ekspresija antigena.
3.3 LIPOSOMI Liposomi so uni- ali multilamelarni kroglasto oblikovani skupki različnih lipidov. Hidrofilne molekule DNA obdamo s hidrofobnimi lipidi in jih na ta način spravimo v celice skozi za DNA neprehodno celično membrano. Proteine in druge nelipidne molekule lahko vstavimo v lipidno membrano liposomov in tako vplivamo na njihovo obstojnost v organizmu ali na specifičnost vezave na tarčne celice. Tehnološki postopek za proizvodnjo liposomov je zelo zapleten. Večinoma je DNA, ki jo želimo uporabiti za gensko terapijo, velika v primerjavi z liposomi in je zaradi tega inkapsulacija le – te lahko zelo težavna in neuspešna. Liposome glede na njihov naboj razdelimo na kationske in anionske:

1. Kot prve liposome so uporabili anionske, ki so vsebovali gen za inzulin ter jih vbrizgali v podgane. Dosegli so dobre rezultate. Kasneje pa so poskusi z anionskimi liposomi z DNA razkrili, da so njihove tarčne celice predvsem retikuloendotelijske celice jeter, zaradi česar le malo teh liposomov doseže druge tarčne celice. Temu pojavu se lahko izognemo z vgradnjo proteinov, proteinskih ligandov ali antigenov v zunanjo plast liposomov, kar izboljša njihovo celično specifičnost.
2. Kationski liposomi imajo drugačne lastnosti. Genska informacija, ki jo nosijo, se izraža praktično v vseh organih, če liposome prejmejo po svojih dovodnih žilah. Uporabljajo se lahko za gensko terapijo pljučnega epitelija in sicer kot aerosol ali kot tekočina. Zaenkrat kationski plazmidi ne kažejo nobenih toksičnih učinkov pri poskusnih živalih.

3.4 DNA-PROTEINSKI KOMPLEKSI
Celično specifični vektorski sistemi izkoriščajo celično specifične površinske receptorje. S tem ko spojimo receptorski ligand s transgensko DNA, omogočimo njen selektiven vstop v celice. Ta metoda ima velik potencial, saj omogoča specifičen genski prenos brez spremljajočih problemov virusnih vektorjev.
Spojitev liganda z DNA je možna na več načinov. Uporabljajo se polikationi, kompleksi protitelo-antigen ter povezovalci (linkerji) tipa biotin-streptavidin. Precej se uporablja polikation poli-L-lizin, ki ga lahko kemično povežemo s kopico proteinskih ligandov, na nastale komplekse pa se elektrostatično veže še DNA. Ligand po vezavi na receptor povzroči endocitozo kompleksa. Kot receptorji kompleksov so uporabni tudi ogljikovi hidrati na površini celic ter za hepatocite specifičen asialoorosomukoidni receptor in receptor za transferin.

4. KLINIČNA UPORABNOST

Genska terapija je ena najmlajših oblik zdravljenja. Obeta številne možnosti za spopad s prirojenimi in pridobljenimi boleznimi (npr. rak in virusne okužbe, posebno HIV). Raznolikost obravnavanih bolezni zahteva različne načine genskega zdravljenja:
1. nadomestitev okvarjenega gena,
2. popravilo gena,
3. inaktivacijo gena ali
4. ektopično sintezo terapevtskih beljakovin.

4.1 NADOMESTITEV GENA
Prirojene bolezni in rak se razvijejo, kadar je okvarjeno ali moteno delovanje celičnih beljakovin. Koncept nadomestitve okvarjene beljakovine temelji na dostavi normalnega gena in njegovi vključitvi v genom tarčne celice. Okvarjeni alel je ob tem še naprej del genoma. Nadomestitev funkcije okvarjenega gena je učinkovita pri recesivno podedovanih boleznih. Pri dominantnem dedovanju pa gensko okvaro težko preglasi ali pa se produkt normalnega alela poveže z beljakovino defektnega alela, kar prvo inaktivira, oziroma onemogoči njeno delovanje (glej nadaljevanje). Poleg težav z dostavo in vstavljanjem gena v tarčni genom velja omeniti tudi težavno uravnavanje izražanja vstavljenega gena: biti mora zadostno, da doseže terapevtski učinek, a hkrati ne tako veliko, da bi moglo škodovati. V tem pogledu je najboljša povezava transgena z njemu lastnimi promotorskimi in regulatornimi sekvencami.

4.2 POPRAVILO GENA
Kadar so za nastanek bolezni odgovorne točkovne ali manj obširne mutacije, dostopne za popravilo, lahko sintezo okvarjene beljakovine preprečimo na ravni DNA z indukcijo celičnih mehanizmov za popravilo neujemanja (angl. mismatch repair) s himernimi RNA/DNA oligonukleotidi ali pa mRNA okvarjenega gena popravimo z ribocimi. Popravilo ima dvoje prednosti pred nadomestitvijo gena: izražanje gena ostane še naprej pod nadzorom izvornega promotorja, sinteza okvarjene beljakovine pa se zmanjša. Slednje je pomembno pri zdravljenju bolezni z dominantnim dedovanjem, kjer okvarjen genski produkt pogosto interagira z normalnim in ovira njegovo funkcijo.

4.2.1 RIBOCIMI
Ribocimi so molekule RNA s kompleksno sekundarno in terciarno strukturo, ki so kot encimi sposobni katalize. V grobem jih delimo po strukturi in funkciji (katalitični dejavnosti). Katalizirajo lahko različne reakcije: samoizrezovanje, specifično cepljenje fosfodiesterskih vezi drugih molekul RNA ter ligacijo. V kontekstu popravila genov se bomo srečali z intronskimi ribocimi 1. skupine, pri inaktivaciji genov pa s t.i. hammerhead ribocimi.
Intronski ribocimi 1. skupine katalizirajo samoizrezovanje, pri čemer se iz primarnega mRNA prepisa izrežejo introni in nastane zrela mRNA. Z genskim inženirstvom lahko izdelamo sintetične ribocime, ki vsebujejo zaporedje nukleinskih kislin za specifično vezavo na zrelo tarčno mRNA. Pripojimo jim tudi zaporedja z zapisom za normalen odsek gena, ki bo nadomestil okvarjeno gensko informacijo. Sintetični intronski ribocim 1. skupine tako katalizira reakcijo trans-izrezovanja (slika 3).

4.2.2 HIMERNI RNA/DNA OLIGONUKLEOTIDI
Kadar popravilo gena cilja na zamenjavo enega samega baznega para v DNA (točkovna mutacija) ga lahko vodi sintetičen oligonukleotid. Himerni RNA/DNA oligonukleotid ali himera (gr. mozaik) je enovijačna molekula, sestavljena iz RNA in DNA (slika 4: rdeča-RNA, črna- DNA). Navadno vsebuje 70 do 80 nukleotidov s komplementarnimi zaporedji, zaradi česar se zvije v značilno obliko - dvojno lasnico. Med komplementarnimi zaporedji, ki so enaka zaporedjem v tarčnem genu, je bazni par, ki bo vodil popravilo točkovne mutacije (slika 4: par CG-turkizna barva). Oblika dvojne lasnice in kombinacija DNA in RNA omogoča oligonukleotidu trdno povezavo s tarčo in odpornost na nukleaze.
Himera vodi zamenjavo nukleotidov v dveh stopnjah. V prvi fazi hibridizira s komplementarnim tarčnim zaporedjem. Na mestu točkovne okvare gena nastane neujemanje, ki sproži celične popravljalne mehanizme. Ti zamenjajo tisti nukleotid v tarčni DNA, ki se pari s centralnim nukleotidom DNA odseka himernega oligonukleotida. Himera se odcepi in pusti za seboj neujemajoč se bazni par v tarčni DNA. Tega v drugi fazi odpravijo popravljalni mehanizmi (slika 4).

4.3 INAKTIVACIJA GENA
Zaviranje izražanja določenih genov je danes najširše uporabljano gensko zdravljenje, ki je namenjeno najrazličnejšim boleznim, zlasti virusnim okužbam in raku. Poznamo dva pristopa: zaviranje izražanja genov s protismernimi oligonukleotidi in ribocimi.

4.3.1 PROTISMERNI OLIGONUKLEOTIDI
Protismerni (angl. antisense) oligonukleotidi so kratke, 15 do 20 baz dolge, enovijačne molekule DNA. Zaporedje nukleinskih kislin je komplementarno odseku mRNA tarčnega gena. Protismerna DNA se po zgradbi nekoliko razlikuje od genomske DNA, kar ji omogoča boljšo obstojnost v organizmu (odporna je na nukleaze in ima manj nespecifičnih učinkov).
Protismerni oligonukleotidi zavirajo izražanje tarčnega gena tako, da hibridizirajo z njegovo mRNA. Nastali RNA/DNA dupleks ovira prevajanje v beljakovino in sproži delovanje RNaze H, ki razreže RNA v dupleksu.
Poznamo tudi nespecifične učinke protismernih oligonukleotidov, ki so večinoma posledica njihove polianionske narave. Kot taki se namreč vežejo na različne beljakovine in ovirajo njihovo dejavnost (npr. zavirajo koagulacijo krvi). Poleg tega lahko nekatera značilna zaporedja nukleinskih kislin sprožijo imunski odgovor.

4.3.2RIBOCIMI, KI SPECIFIČNO CEPIJO FOSFODIESTERSKE VEZI
Med navedene ribocime (angl. trans-cleaving ribozymes) spadajo t.i. hammerhead ribocimi. Zgrajeni so iz katalitske sredice, ki jo obdajata roki z zaporedjema, komplementarnima tarčni mRNA, ki jo želimo inaktivirati (slika 5).

4.4 EKTOPIČNA SINTEZA TERAPEVTSKIH PROTEINOV
Kadar je vzrok za bolezen pomanjkanje določene beljakovine (npr. rastnih faktorjev), lahko v procesu genskega zdravljenja v neke celice, ki sicer ne izražajo tega proteina, vnesemo gen za manjkajočo beljakovino in sprožimo njeno izražanje ter izločanje v krvni obtok. Tako lahko sprožimo izražanje koagulacijskih faktorjev (faktor VIII in IX), rastnih faktorjev (IGF-1, eritropoetin) in peptidnih hormonov (rastni hormon, GHRF).
Za ektopično sintezo proteinov najpogosteje uporabljamo celice skeletne mišičnine. Glavna razloga sta preprosta dostopnost z intramuskularno injekcijo in velikost celične mase.
Ektopična sinteza je na splošno cenejša in bolj ustrezna kot uporaba rekombinantnih proteinov ter koncentratov, ki izvirajo iz plazme. Poleg tega je s tem postopkom znižano tveganje za prenos bolezni kot sta npr. hepatitis in HIV.

4.5 GENSKA TERAPIJA RAKA
Rak se razvije kot posledica kopičenja mutacij v ključnih genih, ki nadzorujejo rast in razmnoževanje celic. S širjenjem vedenja o nastanku raka se razvijajo različni alternativni pristopi k terapiji, ki bodo v obliki genskega zdravljenja nekoč morda učinkovito dopolnilo ali celo nadomestilo klasičnim metodam zdravljenja.

4.5.1 INAKTIVACIJA ONKOGENOV
Nekatere stopnje tumorskih sprememb nastanejo ob aktivaciji onkogenov. S pristopom genskega zdravljenja želimo zavreti izražanje onkogenih proteinov na ravni prepisovanja ali prevajanja.

4.5.2 ZAMENJAVA ALI POPRAVLJANJE TUMOR-SUPRESORSKIH GENOV
Razvoj neoplazije je povezan z mutacijami v številnih tumor-supresorskih genih. Zato se kot terapija predrakavih in rakavih stopenj zdi obetavna možnost zamenjave ali popravila okvarjenih zaviralnih genov.

4.5.3 CELIČNA SMRT
S specifičnim dostavnim sistemom bi bilo mogoče v tumorske celice vnesti gene za encime, ki bi neko netoksično predzdravilo pretvorili v toksin, ki bi zaustavil metabolično obračanje in s tem delitev celice. Poznamo človeku lastne gene s tovrstnim delovanjem (npr. deoksicitidinska kinaza), še primernejši pa bi bili tuji geni (saj potemtakem ne bi prišlo do pretvorbe predzdravila v toksični metabolit zares v nobeni drugi celici kot v tistih, ki bi jim poprej vstavili za pretvorbo potreben encim). Kot primer navedimo timidinsko kinazo HSV. Ta fosforilira protivirusno zdravilo ganciklovir, ki se nato vgradi v molekulo DNA in zavira sintezo in prepisovanje DNA.

4.5.4 VIRUSNO POSREDOVANA ONKOLIZA
Nekateri virusi, npr. adenovirusi in HSV, se iz okuženih celic širijo ob citolizi. Mehanizem lize gostiteljskih celic bi lahko uporabili pri zdravljenju tumorjev. Metoda bi bila uspešna, če bi zagotovili selektivno razmnoževanje virusov v tumorskih celicah in onemogočili njihovo razmnoževanje v zdravem tkivu. Poznamo dve strategiji za pripravo ustreznih virusnih vektorjev. Po prvi bi moral biti virusni gen za replikacijo pod nadzorom nekega specifičnega promotorja, ki ga najdemo le v tumorskih celicah. Drugo možnost predstavlja izrezovanje virusnih genov, ki so potrebni za pomnoževanje v normalnih celicah, vendar niso potrebni za replikacijo znotraj tumorskih celic.
Onkoliza lahko sproži tudi naravni imunski odziv organizma proti tumorjem, saj se ob lizi celic v intersticij sprostijo sicer skriti tumorski antigeni. Slednje bi lahko omogočilo celo uničenje oddaljenih metastaz, ki jih virusni vektorji ne bi dosegli.
Prednost z virusi posredovane onkolize je v tem, da se začetna doza virusa s časom povečuje in samostojno širi v tumorskem tkivu. Prav tako ne zahteva dolgotrajnega izražanja genov.

4.5.5 IMUNOMODULACIJA
Večina tumorskih celic je slabo imunogenih. Tudi tumorska rast je pogosto povezana z oslabitvijo imunskega sistema. Če bi torej imunski sistem spodbudili npr. s citokini, bi obnovili njegovo naravno sposobnost obrambe proti neoplazijam.

4.5.5.1 EKTOPIČNA EKSPRESIJA CITOKINOV
S poskusi so pokazali, da različni citokini, ki se ektopično izražajo v tumorskih celicah ali v njihovi neposredni bližini, zavirajo tumorsko rast. Tumorska celica, ki jo gensko tako spremenimo, da izloča citokine, se in vivo razmnožuje počasneje. In vitro sprememb v hitrosti razmnoževanja ne opazimo, saj so za zaviranje tumorske rasti potrebni tudi dejavniki, ki v organizmu sprožijo odgovor na citokine.

4.5.5.2 IZBOLJŠANJE IMUNSKEGA ODGOVORA
Imunski odgovor na tumorske celice se lahko izboljša, kadar tumorska celica na površini izraža visoko imunogene molekule (npr. tuje MHC molekule, ki sprožijo zavrnitveno reakcijo). Neoplastične celice lahko spremenimo tudi tako, da na površini izražajo kostimulatorne molekule, ki omogočajo učinkovitejšo vezavo citotoksičnih limfocitov T ob stiku s sicer šibko imunogenimi molekulami.

4.5.6 ZAŠČITA OB KEMOTERAPIJI
Kemoterapija se uporablja kot učinkovito terapevtsko sredstvo za zdravljenje rakavih obolenj. Pri nekaterih vrstah tumorjev se njen učinek pokaže šele pri velikih odmerkih, ki jih spremljajo hudi neželeni učinki, ki so povezani zlasti z oslabljenim imunskim odgovorom na patogene zaradi okvare celic naravnega in pridobljenega obrambnega sistema.
Nekateri tumorji imajo gene, s katerimi se varujejo pred citotoksičnimi učinki citostatikov. Eden izmed takšnih je gen MDR-1, ki spada v družino genov, ki kodirajo transportne beljakovine za odpornost na številna zdravila. Toksične učinke kemoterapije bi lahko zmanjšali z vnosom zaščitnih genov MDR-1 v progenitorne celice kostnega mozga, kar že preizkušajo v kliničnih poskusih. Tako bi ohranili za ustrezno obrambo telesa potrebno število celic naravnega in imunskega odgovora kljub visokim dozam kemoterapevtika.

4.5.7 DNA CEPIVO
V celice kože ali mišic bi z ustreznim dostavnim sistemom lahko vnesli gen za specifičen antigen. Ob izražanju antigena v gostiteljskih celicah bi sprožili humoralni in celični imunski odziv. Ta postopek bi služil kot cepljenje za zaščito pred infekcijskimi in neinfekcijskimi boleznimi. Njegove prednosti pred klasičnimi cepivi so spodbujanje obeh vrst specifičnega imunskega odziva, odsotnost tveganja za okužbo z oslabljenim patogenom in cenovna dostopnost. Omejitve DNA cepiv predstavljajo relativno šibek humoralni imunski odgovor, tveganje za insercijsko mutagenezo in možnost avtoimunske reakcije.

5. DEDNE BOLEZNI, PRIMERNE ZA GENSKO TERAPIJO

5.1 BOLEZNI IMUNSKIH POMANJKLJIVOSTI
Te bolezni so primer uporabe ex vivo genskega prenosa v hematopoetske zarodne celice. Uspešnost zdravljenja je omejena zaradi nizke učinkovitosti pri transdukciji hematopoetskih zarodnih celic.

5.1.1 POMANJKANJE ADENOZIN DEAMINAZE (ADA)
Odsotnost adenozin deaminaze vodi v akumulacijo dATP, ki je toksičen za limfocite T in B; bolniki imajo ponavljajoče se in življenje ogrožujoče infekcije zaradi defektnega celičnega in humoralnega imunskega odziva.
Standardna terapija je transplantacija kostnega mozga in ponavljajoče se infuzije s polietilen glikolom sklopljenega rekombinantnega encima.
To je prva bolezen, ki so jo klinično zdravili z gensko terapijo s pomočjo infuzije T limfocitov iz periferne krvi, transduciranih z retrovirusnim vektorjem (ki je vseboval človeški ADA gen).
Ker uporaba zrelih T limfocitov ne povrne imunske obrambe docela, so kasnejši poskusi uporabljali ex vivo gensko terapijo na hematopoetskih zarodnih celicah (te se lahko diferencirajo v vse tipe krvnih celic).
Problemi so nizka uspešnost pri transdukciji hematopoetskih celic. Težava je tudi, da se transgeni v retrovirusnih vektorjih slabo izražajo v nedelečih se T limfocitih. Lentivirusni vektorji bi dosegli boljši nivo transdukcije, vendar obstajajo skrbi glede varnosti.

5.1.2 NA KROMOSOM X-VEZANA HUDA KOMBINIRANA IMUNSKA POMANJKLJIVOST (SCID-severe combined immunodeficiecy)
Tu gre za mutacije v genu za γ verigo citokinskega receptorja (lokaliziran na X kromosomu). Dejansko je to smrtni sindrom imunske pomanjkljivosti zaradi slabe diferenciacije limfocitov.
Zdravi se z gensko terapijo, ki uporablja hematopoetske zarodne celice (ex vivo transdukcija, retrovirusni vektorji).

5.1.3 KRONIČNA GRANULOMATOZNA BOLEZEN
Ta bolezen nastane zaradi mutacije v enem od štirih genov, ki kodirajo oksidazno-encimski kompleks, ki proizvaja superoksid v fagocitirajočih levkocitih. Posledica je nezmožnost spopada z bakterijskimi in glivičnimi infekcijami.
Genetska korekcija že zelo majhnega deleža cirkulirajočih fagocitov bi zadoščala za vidne koristi (neprizadete prenašalke te X-vezane lastnosti imajo le 5 oksidazno-pozitivnih nevtrofilcev).
Standardna terapija je alogenska transplantacija kostnega mozga. Možna pa bi bila tudi genska terapija z uporabo zarodnih celic iz periferne krvi (ex vivo transdukcija, retrovirusni vektorji).

5.2 JETRNE BOLEZNI
Razlike med in vivo in ex vivo prenosom:
1. in vivo genski prenos: direktno injiciranje, intravenski ali intrabiliarni vnos vektorjev;
2. ex vivo genski prenos: delna resekcija jeter, izolacija hepatocitov in in vitro transdukcija, nato reimplantacija v jetra.
3. Selektivnost genske terapije omogočajo specifični receptorji na hepatocitih, ki posredujejo endocitozo.

5.2.1 DRUŽINSKA HIPERHOLESTEROLEMIJA
Zaradi pomanjkanja ali disfunkcije LDL receptorja, jetra slabo čistijo LDL partikle iz krvi. Posledično pride do ekstremno visokega nivoja plazemskega holesterola in zgodnjega pojava ateroskleroze.
Možnosti zdravljenja:
1. transplantacija jeter, ki normalizira raven lipidov v krvi in upočasni napredovanje ateroskleroze;
2. genetska modifikacija jeter, da začnejo izražati LDL receptor; poskusi z ex vivo dostavo DNA (retrovirusni vektorji) v izolirane hepatocite pacientov (delna hepatektomija): uspešni, varna in potencialno učinkovita terapija.

5.2.2 HEMOFILIJA A
Zaradi pomanjkanja koagulacijskega fakorja VIII pride do tveganj za spontane krvavitve, ki so lahko življenjsko ogrožujoče.
Standardna terapija vključuje pogoste infuzije faktorja VIII, izoliranega iz plazme. Slabosti so tveganje za infekcije, ki se prenašajo s krvjo, in nepripravnost ter neprijetnost postopka.
Zanimiva je ugotovitev, da že zelo majhni (5 normalnega) nivoji faktorja v krvi omilijo smrtnost bolezni. Zato so poskušali z ektopično sintezo tega faktorja, vendar so bili slabo uspešni (v nasprotju s hemofilijo B - pomanjkanje faktorja IX). Faktor kodira velik gen (nad 7kb), zato so prišli v poštev le retrovirusni in adenovirusni vektorji; možna pa je tudi sinteza rekombinantnih AAV vektorjev z okrajšano obliko gena velikosti 4,4kb (proteinu se s tem ne zmanjša aktivnost).
Izvajajo se tudi poskusi genske terapije na jetrih v živalih z in vivo (intravensko) in ex vivo dostavo.
Glavni problem je možnost razvoja inhibitornih protiteles proti transgenu (inhibitorna protitelesa so pogost problem tudi pri proteinski terapiji hemofilije A in B).

5.3 HEMOGLOBINOPATIJE
Anemijo srpastih celic in talasemije bi bilo mogoče zdraviti z ex vivo gensko transformacijo hematopoetskih zarodnih celic, ki bi nato obnovile bolnikov kostni mozeg in izražale specifičen vneseni gen.
Potrebno je razviti vektorje, ki so sposobni dolgoročnega izražanja terapevtskih nivojev globinskih genov. Najbolj uspešen in vivo pristop do sedaj temelji na uporabi retrovirusnih vektorjev, ki nosijo zapis za -globin.

5.4 PLJUČNE BOLEZNI
Genske vektorje najpogosteje prenesemo do respiratornega epitelija z aerosolnimi sistemi. Respiratorni epitelij je precej odporen proti tujkom (vključno z vektorji): ciliarni epitelij, sluz, glikokaliks lahko preprečijo vezavo na površinske celične receptorje; apikalna celična membrana ima malo receptorjev za virusne vektorje in nizko stopnjo endocitoze.

5.4.1 CISTIČNA FIBROZA
V številnih kliničnih študijah so uporabljali adenovirusne vektorje za prenos gena CFTR v celice respiratornega epitelija bolnikov, vendar kljub naravnemu tropizmu do respiratornega epitelija ti vektorji niso dovolj učinkoviti zaradi kratkotrajne ekspresije. Izzovejo tudi močan imunski odgovor. Zato bi bili bolj primerni AAV vektorji (adenovirusom pridruženi virusi). Z njimi bi dosegli stabilnejšo ekspresijo in blažje vnetje.
V kliničnih študijah uporabljajo tudi liposome, vendar tudi ti povzročijo le kratkotrajno ekspresijo.

5.4.2 POMANJKANJE ΑLFA 1-ANTITRIPSINA
Ti bolniki so nagnjeni k pljučnemu emfizemu (na mestih vnetja se sproščajo nevtrofilne proteaze, ki poškodujejo pljučno tkivo) in jetrni cirozi. α1-antitripsin se normalno ne izraža v respiratornem epiteliju, če pa bi dosegli izražanje z vnosom gena v celice pljučnega epitela, bi to preprečilo poškodbe pljuč.
Trenutno se za terapijo uporablja rekombinantni α1-antitripsin, vendar je terapija zelo draga. Študije na živalih so pokazale, da lahko α1-antitripsin prenesemo do pljuč po krvi ali bronhih s kationskimi liposomi.

5.5 SKELETNA MIŠICA
Skeletna mišica predstavlja številne ovire za prenos genov: velika masa mišičnega tkiva, permeabilnostna bariera (endotel, zunajcelični matriks). Adenovirusi imajo nizko stopnjo infektivnosti zrelega mišičnega tkiva (prenos genov je najbolj učinkovit pri nezrelih mišičnih vlaknih) in kratkotrajno ekspresijo. Zato bi bili primernejši HSV vektorji (infektivnost ni odvisna od zrelosti mišičnega tkiva) in AAV vektorji (stabilna ekspresija).

5.5.1 DUCHENNOVA MIŠIČNA DISTROFIJA
Povzroča jo pomanjkanje gena za distrofin. Sekvenca, ki kodira ta protein je zelo velika (14kb), kar izključuje uporabo vektorjev z omejeno prenosno kapaciteto (AAV vektorji in prva generacija adenovirusnih vektorjev). Študije na miših so pokazale, da so novejši adenovirusni vektorji (z večjim delom odstranjenih virusnih genov) sposobni prenosa celotne sekvence.

5.5.2 RAMENSKO MEDENIČNA MIŠIČNA DISTROFIJA
Pri tej skupini genetskih bolezni gre za mutacije genov za α-, β-, γ- in δ-sarkoglikan, transmembranski glikoprotein, ki tvori kompleks z distrofinom. Sarkoglikane kodira majhna genska sekvenca, ki jo lahko prenesemo z rekombinantnimi AAV.