http://andper.net april 2005
(PDF dokument)


0. PREDGOVOR

Spoštovani/a študent/ka,
pred tabo je seminarska naloga, napisana na eno izmed tem, ki se
obravnavajo pri predmetu biokemija II na MF UL.
Kot podlaga nam je avtorjem služila ena od seminarskih nalog, ki so že bile
objavljene na MedenemSrcu (http://medenosrce.ksmf.org) in sedaj, ko smo
svoje delo uspešno opravili ter prejeli lepe ocene, v želji pomagati nadaljnjim
generacijam študentov, tudi mi objavljamo svojo, nekoliko predelano
različico, na internetu.
Naj le še opomnimo, da je dotična seminarska naloga nalašč brez
naslovnice in brez slik, ki so sicer za dobro razumevanje snovi vsekakor nujno
potrebne. Vse ti pač ne more biti postreženo na pladnju. =)
Za morebitne vsebinske napake ne odgovarjamo. Veliko sreče pri
interpretaciji in lep pozdrav!
Nikola, Andrej, Andrej
DM03


- 1 -
http://andper.net april 2005
I. UVOD
Telomere so nukleoproteinske strukture na koncih kromosomov, ki so se v
evoluciji ohranile vse od enoceličnih evkariontov do sesalcev, kar kaže na
njihovo pomembno varovalno vlogo v preprečevanju razgradnje
kromosomskih koncev. Služijo kot zaščitne kapice, omogočajo podvajanje
kromosomov in so nekakšna biološka ura. Pri vsaki delitvi somatskih celic se
izgubi del telomer. Brez telomernih kapic bi se človeški kromosomi združili in
tvorili multicentrične kromosome. Le-ti bi se med mitozo lomili, posledice pa
bi bile hude genomske poškodbe, ki vodijo v celično apoptozo.
Somatske celice imajo omejeno obdobje podvajanja, ki traja približno
petdeset delitev. Tumorske celice pa imajo veliko količino encima
telomeraza, ki podaljšuje telomere. Zato se imenujejo nesmrtne celice.
Znanstveniki si prizadevajo, da bi aktivirali sintezo telomeraze v zdravih
somatskih celicah (podaljšali življenje in preprečili bolezni, ki so povezane s
staranjem) in inhibirali telomerazo v rakastih celicah (povzročili njihovo
apoptozo).
II. TELOMERE
Zgradba telomerne DNA
Večina telomer je zgrajena iz kratkih, enostavnih, ponavljajočih se
oligonukleotidnih zaporedij. Telomere sesalcev imajo 5 do 25 kilobaz dolge
ponovitve šestih nukleotidov TTAGGG v smeri 5 -> 3 proti koncu
kromosoma. To pomeni, da so bogata z gvanini (G-nukleotidi) na tisti verigi
dvojne vijačnice, ki je 3-konec kromosoma. Nasprotna veriga vijačnice
(5-konec) pa je bogata s citozini (C-nukleotidi). C-bogata veriga je nekoliko
krajša od G-bogate, zaradi česar nastane enoverižni 3-previs. Telomere se ne
končajo linearno, ampak tvorijo zankaste strukture (T-loop) s 3 G-bogatimi in
- 2 -
http://andper.net april 2005
5 C-bogatimi verigami, tako da nastane Holliday-eva križna struktura.
Formacijo in vzdrževanje T-loop strukture pa olajšujejo proteini, ki se na
koncu vsakega kromosoma vežejo na DNA.
III. TELOMERAZE
Običajne polimeraze DNA ne morejo sintetizirati G-bogatih 3-koncev, zato
je za ohranjanje telomerne dolžine potreben encim telomeraza.
Telomeraza je ribonukleoproteinski kompleks, ki dodaja nukleotide na
konce kromosomov. Sestavljena je iz proteinske in RNA komponente. Na delu
RNA komponente, ki se imenuje matrica, se vrši reverzna transkripcija.
Proteinski del ima tri funkcije. Veže RNA, veže DNA in katalizira
podaljševanje 3-koncev, morda pa sodeluje tudi pri translokacijskem
procesu.
Telomerazni reakcijski cikel
Med telomernim podaljševanjem se telomerni 3-previs DNA molekule z
nukleotidnimi bazami poveže z RNA regijo telomeraze. Nato se lahko začne
reverzna transkripcija, za katero se večkrat znova uporabi le določeno kratko
nukleotidno zaporedje telomerazne RNA komponente. To zaporedje pa je
komplementarno telomernemu zaporedju nukleotidov na kromosomih. V
vsakem transkripcijskem ciklu se doda ena telomerna ponovitev. 5-konec
matrične verige je pozicija, kjer telomerni substrat najverjetneje ali takoj
oddisociira ali pa poteče translokacija na začetek matrice in cikel dodajanja
nukleotidov se ponavlja, dokler telomeraza in DNA vijačnica dokončno ne
disociirata.
- 3 -
http://andper.net april 2005
Mehanizem translokacije
Matrica se bere v smeri 3 -> 5 in ko se prepiše do 5-konca, se telomerna
regija DNA verige spet prestavi na 3-začetek matrice. To reakcijo imenujemo
translokacija.
Translokacija vključuje razdrtje baznih parov v DNA-RNA hibridu, premik na
začetek matrice RNA in ponovno vzpostavitev DNA-RNA interakcije. Ni točno
znano, koliko baznih parov mora ostati povezanih, da pride do translokacije.
Predvidevajo, da nastajanje G-G zank oz. G-kvadrupleksov (G4) v nastajajoči
telomeri znižuje aktivacijsko energijo za translokacijo.
Multimerizacija hTERT (človeške telomerazne reverzne
transkriptaze)
Človeške telomeraze tvorijo višje urejene dimere in vsak telomerazni
kompleks vsebuje dve RNA molekuli. Telomerazni RNA matrici sta v aktivnem
encimu soodvisni in funkcionalno sodelujeta druga z drugo.
Predvideni so trije modeli, kako telomerazne matrice RNA sodelujejo med
seboj:
1) izmenjavanje matric
Dve telomerazni matrici se za reverzno transkripcijo uporabljata
izmenično.
2) “sidriščno” mesto
Ena matrica stabilizira interakcijo s telomero, medtem ko se druga matrica
uporablja za reverzno transkripcijo.
- 4 -
http://andper.net april 2005
3) paralelno podvajanje
Dva kromosomska konca se podaljšujeta sinhrono. Tako se lahko vodilna in
zaostajajoča veriga podaljšujeta hkrati.
Uravnavanje telomerazne aktivnosti
Obstajata dva modela, kako dva proteina (Cdc13p in Est1) delujeta in
vplivata na aktivnost telomeraze:
1) model zbiranja
Na telomero se najprej veže Cdc13p, ki v pozni S fazi celičnega ciklusa
omogoča vezavo Est1. Nato se vežejo še preostale komponente telomeraze.
2) model aktivacije
Telomeraza je vezana na telomero, a je neaktivna vse do pozne S faze, ko
se Est1 poveže z njo in jo potem, ko se poveže še s Cdc13p, aktivira.
Asimetrija kromosomskih koncev
Pri replikaciji se tvorita dve različni hčerinski molekuli. Telomera vodilne
verige nastane z neprekinjeno sintezo G-bogate verige v 5 -> 3 smeri proti
koncu kromosoma, pri čemer je starševska veriga vsebovala področje na
5-koncu, ki je bogato s citozini. Telomera zaostajajoče verige, ki se sintetizira
diskontinuirano, pa se je sintetizirala ob starševski verigi z G-bogatim
področjem na 3-koncu.
Po principu semikonzervativne DNA replikacije bi pričakovali, da 3-konec
nastane le na zaostajajoči verigi, vendar novejše raziskave kažejo, da temu ni
tako. Pri človeku naj bi imela glavna veriga relativno kratek, z gvaninom
bogat 3-konec, medtem ko naj bi bil 3-konec zaostajajoče verige dolg okoli
150-200 nukleotidov.
- 5 -
http://andper.net april 2005
Krajšanje in podaljševanje telomer
Posledica telomerazne neaktivnosti je krajšanje telomer. Sinteza vodilne
verige se konča prehitro, ker nima matričnega dela za sintezo 3-previsa.
Hitrost krajšanja naj bi torej bila premosorazmerna z dolžino 3-previsa. Do
tega pa ne pride, ker je telomeraza sposobna dodajati telomerna
ponavljajoča se zaporedja na 3-konec na novo sintetizirane vodilne verige.
IV. TELOMERE IN TELOMERAZE KOT TARČE ZA ZDRAVILA
Telomere preprečujejo združevanje kromosomov, druga njihova bistvena
naloga pa je preprečevanje izgube oz. odcepljanja posameznih nukleotidov iz
kateregakoli konca kromosoma.
Do izgube nukleotidnih parov lahko pride zaradi dveh razlogov:
1) problem replikacijskega konca
Do tega pride, ker je mehanizem podvojevanja DNA zastavljen tako, da ne
more podvojiti zadnjih nekaj parov zaostajajoče verige med sintezo DNA.
2) eksonukleaze
Eksonukleaze delujejo v 5 -> 3 smeri in skrajšujejo CA bogata področja
telomer.
Uravnavanje sinteze in združevanja elementov, pomembnih za
telomerazno delovanje
Človeški telomerazni encim sestoji iz dveh podenot:
1) katalitična podenota (hTERT - human telomerase reverse
transcriptase)
- 6 -
http://andper.net april 2005
2) telomerazna RNA (hTR – human telomerase RNA template)
Za nastanek funkcionalnega encima oz. aktivne telomeraze so nujno
potrebni še pomožni proteini Hsp90, p23 in TEP-1.
mRNA za hTERT
Oligonukleotidi, ki so komplementarni nukleotidnemu zaporedju mRNA za
hTERT, lahko z njo tvorijo hibride in tako onemogočijo njeno izražanje.
Ribocimi so prav tako sposobni zavreti izražanje mRNA. So majhne
molekule RNA, ki so iz katalitičnega dela, na katerem so nukleotidna
zaporedja, ki prepoznajo mRNA. Te molekule RNA so endoribonukleaze, ki
razgrajujejo mRNA.
Izražanje hTERT
Izražanje hTERT je zelo regulirano na transkripcijski ravni. Identificiranih je
kar nekaj transkripcijskih faktorjev, ki uravnavajo ekspresijo genov za hTERT.
Eden takih faktorjev je c-MYC, ki inducira aktivnost telomeraze tako, da
poveča transkripcijo mRNA za hTERT. Torej je “zdravstveni” cilj nekako
onesposobiti ekspresijo tega gena. Odkrite so bile specifične Gkvadrupleksne
strukture, ki delujejo na promotor gena za c-MYC in s tem
onesposobijo njegovo izražanje.
Elementi, ki so pomembni za telomerazno dejavnost, kot tarče za
zdravila
V rakastih celicah, kjer so telomeraze aktivne, so le-te dobra tarča za
zdravila proti raku.
Določene sintetične molekule, ki se vežejo na komponente telomeraznega
kompleksa, imajo funkcijo “on/off” stikala. Zanimive so predvsem tiste, ki
izključijo telomeraze, pa čeprav so le-te v danem trenutku najbolj dejavne,
- 7 -
http://andper.net april 2005
kot je to ponavadi v rakastih celicah. Danes poznamo take, ki inhibirajo
hTERT in hTR.
Modificirane RNA in DNA molekule se lahko vežejo na matrično RNA v hTR
podenoti, kjer delujejo kot kompetitivni inhibitorji in preprečujejo
transkripcijo. V teh molekulah lahko z različnimi sladkornimi fosfodiestrskimi
modifikacijami povečamo afiniteto (in posledično specifičnost) teh molekul za
matrični del RNA v hTR ter olajšamo njihov vstop v celice, kar je bistvenega
pomena za intaktno dostavo zdravila do želene tarče.
Kot že rečeno, lahko telomerazo inhibirajo tudi majhne molekule, ki nanjo
delujejo kot katalitični inhibitorji, vendar se v praksi ti načini zdravljenja ne
obnesejo najbolje, ker imajo zakasnel učinek.
Zdravila, ki se direktno vežejo na telomere in stabilizirajo DNA strukture
kot so G-kvadrupleksi (G4), so tudi inhibitorji telomeraze, saj vplivajo na
telomerno zgradbo. Ta zdravila bi lahko v kombinaciji z bolj citotoksičnimi
agensi dala hitrejše odzive v rakastih celicah, ki so manj odvisne od dolžine
telomer.
VIRA
& KELLEHER, TEIXEIRA, FÖRSTEMANN, LINGNER:
Telomerase: biochemical considerations for enzyme and
substrate
TRENDS in Biochemical Sciences, Vol. 27, No. 11, 2002
& REZLER, BEARSS, HURLEY:
Telomeres and telomerases as drug targets
Current Opinion in Pharmacology 2002, 2: 415-423
- 8 -